Avidin-positive mast cells of the liver when exposed to water-soluble silicon for nine months

Full Text

Введение

Тучные клетки – многофункциональные клетки, задействованные во многих физиологических и патологических процессах, происходящих в организме [1, 5]. Ранее нами было обнаружено, что хроническое поступление с питьевой водой кремния приводит к изменению микроморфологического строения печени лабораторных крыс, а также увеличению средней площади тучных клеток, выявляемых толуидиновым синим [2]. Окраска толуидиновым синим позволяет оценить степень зрелости гепарина визуально, его количество можно рассчитать только с помощью индекса сульфатированности [3]. В то же время авидин связывается с гепарином и его флуоресценция прямо пропорциональна количеству гепарина в гранулах тучных клеток [1]. Гепарин – гликозаминогликан, являющийся матриксом для обеспечения оптимального расположения, хранения и регуляции экспорта синтезируемых в клетке медиаторов, в отношении которых он проявляет регуляторные свойства. Кроме того, гепарин, связываясь со многими белками, может препятствовать рекрутированию провоспалительных клеток, адгезию нейтрофилов к эндотелиальным клеткам сосудов [4]. Таким образом, целью работы явилось изучение реакции авидин-позитивных тучных клеток печени на поступление кремния с питьевой водой в концентрации 20 мг/л в течение девяти месяцев.

Материалы и методы

Эксперимент проводился на белых нелинейных крысах-самцах, находившихся в обычных условиях вивария при естественном освещении. Животные (n = 6) были разделены на две группы: контрольную (n = 3), которая получала питьевую бутилированную воду; опытную (n = 3), получавшую ту же самую воду, но с добавлением девятиводного метасиликата натрия в концентрации 10 мг/л в пересчете на кремний. Определение массовой концентрации растворенных форм кремния проводилось с помощью спектрометра эмиссионного с индуктивно связанной плазмой 5110 ICP-OES. Так, в питьевой воде, получаемой животными контрольной группы, содержалось 10 мг/л кремния, а в воде, получаемой опытной группой, – 20 мг/л.

Через девять месяцев животные были выведены из эксперимента, печень извлечена и помещена в 10% нейтральный формалин для последующей заливки в парафин. Срезы печени толщиной 6 мкм после депарафинизации инкубировались 30 минут с авидином, меченным флуоресцентной меткой зеленого цвета. Рабочий раствор готовился из готового меченого авидина (Avidin, Alexa Fluor^® 488 conjugate, Invitrogen, Германия) и 0,1 М фосфатного буфера в соотношении 1:200. Раствор авидина сливался, срезы тщательно промывались в фосфатном буфере. После промывки в фосфатном буфере срезы заключались под покровное стекло в раствор, содержащий фосфатный буфер и глицерин (1:1). Препараты анализировались под люминесцентным микроскопом при длине волны возбуждающего света 495 нм [1, 5].

Микрофотографии с полей зрения, полученные при увеличении объектива × 40, обрабатывали в программе AmScope: подсчитывали среднее количество авидин-позитивных клеток, измеряли площадь и интенсивность флуоресции клеток с помощью функции «цветной куб» в автоматическом режиме.

В целях определения взаимосвязи между площадью клетки и ее интенсивностью флуоресценции рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r_s). При этом сила корреляционной связи считалась слабой при 0 < r_s < 0,29, средней – при 0,3 < r_s < 0,69, сильной – при 0,7 < r_s < 1,0.

Полученные в ходе измерения выборки проверяли на нормальность распределения с использованием критериев Шапиро–Уилка и Колмогорова–Смирнова. Данные имеющие нормальное распределение представляли как среднюю арифметическую со стандартной ошибкой среднего значения, в виде M±m. Статистическую значимость отличий определяли с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок. При ненормальном распределении выборок данные представлялись как медиана (Me) и интерквартильный размах (Q_0,25-Q_0,75). В этом случае для определения статистической значимости использовали U-критерий Манна–Уитни. Различия в обоих случаях считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Авидин-позитивные тучные клетки обладали зеленой флуоресценцией и преимущественно располагались в области портальных зон печени. Визуальная оценка обнаружила увеличение их количества в печени крыс, получавших водорастворимый кремний в концентрации 20 мг/л в течение девяти месяцев, особенно за счет клеток со слабой флуоресценцией, которые, вероятно, содержали слабо сульфатированный гепарин. Также отмечалось увеличение числа дегранулированных клеток в печени крыс опытной группы. Подсчитывали среднее количество клеток в области портальных зон печеночной дольки, так, в контрольной группе их количество составило 15±1,41, а в опытной группе – 17,6±0,71 клеток (р = 0,156). При этом в контрольной группе 26,7% клеток имели слабую флуоресценцию, в опытной – 31,8%. С помощью функции «цветной куб» определяли медиану площади флуоресцирующих клеток, которая составила 14,66 (5,37-34,17) и 20,73 (9,5-48,73) для контрольной и опытной группы соответственно (p = 0,001). Площади клеток распределяли с помощью гистограммы на три группы: малые по размеру (< 38,62 мкм²), средние (38,62-74,80 мкм²) и большие (> 74,80 мкм²) по размеру. Так, в контрольной группе распределение составило 77%, 13% и 10%, а в опытной – 67%, 21% и 12%. Т. е. медиана площади тучных клеток изменялась за счет уменьшения количества клеток малого размера и увеличения количества клеток среднего и большого размера. Определяли среднюю интенсивность флуоресценции среди малых, средних и больших клеток, так, в контрольной группе их интенсивность составила 40,94±2,88 у. е., 60,34±6,54 у. е. и 79,54±6,07 у. е., а в опытной – 78,28±3,83 у. е., 118,25±5,17 у. е. и 103,21±4,68 у. е. соответственно. Проведенный корреляционный анализ подтвердил наличие прямой сильной корреляционной связи между площадью клетки и ее интенсивностью в контрольной группе (r_s = 0,73; p < 0,05) и прямой средней силы корреляционной связи в опытной (r_s = 0,67; p < 0,05) группе.

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что в печени крыс, наряду с увеличением площади авидин-позитивных тучных клеток, происходит увеличение количества гепарина; возрастает количество гепарина в тучных клетках печени крыс опытной группы в сравнении с контрольной.

Заключение

Таким образом, можно сделать вывод, что кремний, поступающий с питьевой водой в концентрации 20 мг/л в течение девяти месяцев, приводит к увеличению медианы площади авидин-позитивных тучных клеток в печени, интенсивности их флуоресценции, а также их количества в области портальных зон за счет клеток со слабой флуоресценцией.

About the authors

E. A. Grigoreva

I.N. Ulyanov Chuvash State University

Author for correspondence.
Email: shgrev@yandex.ru

Assistant, Department of Medical Biology with a Course of Microbiology and Virology

Russian Federation, Cheboksary

V. S. Gordova

Immanuel Kant Baltic Federal University

Email: shgrev@yandex.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Fundamental Medicine of the Medical InstitutePhD (Medicine), Associate Professor, Department of Fundamental Medicine of the Medical Institute

Russian Federation, Kaliningrad

V. E. Sergeeva

I.N. Ulyanov Chuvash State University

Email: shgrev@yandex.ru

PhD, MD (Biology), Professor, Department of Medical Biology with a Course of Microbiology and Virology

Russian Federation, Cheboksary

A. T. Smorodchenko

Medical School of Berlin – University of Health and Medicine

Email: shgrev@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Anatomy Department

Germany, Berlin

N. V. Smirnova

I.N. Ulyanov Chuvash State University

Email: shgrev@yandex.ru

Head, Department of Medical Biology with a Course in Microbiology and Virology

Russian Federation, Cheboksary

References

Supplementary files