Получение колониеформирующих клеток из крови человека и оценка чистоты популяции методом проточной цитометрии

Полный текст

Введение

Колониеформирующие эндотелиальные клетки (Endothelial Colony Forming Cells, ECFCs, КФЭК) представляют собой редкую популяцию поздних эндотелиальных клеток-предшественников (EPC), обладающих высоким пролиферативным потенциалом. В отличие от ранних эндотелиальных прогениторных клеток (eEPCs), КФЭК способны непосредственно встраиваться в эндотелиальный слой поврежденных кровеносных сосудов, участвуя в процессе их регенерации. К тому же ранние эндотелиальные прогениторные клетки имеют гемопоэтическое происхождение, тогда как КФЭК считаются гомогенной популяцией истинных эндотелиальных прогениторов [1]. Они экспрессируют эндотелиальные маркеры, такие как CD31, VE-кадгерин, фактор Виллебранда, CD146, VEGFR2, но не экспрессируют гемопоэтические маркеры CD45 и CD14. Эндотелиальные клетки, наряду с их прогениторами, играют важную роль в регуляции иммунного ответа, выступая в качестве активных участников острых или хронических воспалительных процессов, кроме того, они являются фагоцитирующими клетками [2].

КФЭК представляют интерес для многих приложений. КФЭК способны сформировать эндотелиальный монослой, который придаст функциональные свойства, улучшит тромборезистентность и исход имплантации биоинженерных сердечно-сосудистых протезов [3, 4]. Научные исследования подтверждают, что клеточная терапия эндотелиальными прогениторными клетками ишемизированных тканей (например, при ишемической болезни сердца, инсульте и заболеваниях периферических артерий) способна улучшать процессы репарации, активизировать ангиогенез и снизить фиброзирование зоны повреждения [5, 6]. КФЭК могут выступать ценной моделью для изучения процессов ангиогенеза, эндотелиальной дисфункции и функционирования эндотелиального монослоя в норме и при ряде патологических состояний [7]. Реализация этих направлений подразумевает использование чистых культур эндотелиальных колониеформирующих клеток.

Эндотелиальные колониеобразующие клетки могут быть получены из мононуклеарной фракции периферической крови, что подтверждается работами научных групп Medina, Colombo и др. [8, 9]. Проточная цитометрия является методом выбора для определения фенотипа полученной популяции клеток и оценки ее чистоты.

Материалы и методы

Материалом для получения КФЭК служила донорская кровь из периферической вены, забранная с гепарином. Мононуклеарную фракцию (MNF) выделяли на градиенте плотности Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich, США) в соответствии с инструкцией производителя. Полученные из интерфазы клетки дважды промывали избытком PBS с последующим центрифугированием, суспензию клеток ресуспендировали в полной питательной среде EGM-2 MV (Lonza, Швейцария) c 5% FBS (HyСlone, США), 2% пенициллина/стрептомицина (Invitrogen, США) и 0,25 г/мл амфотерицина B (Invitrogen, США) и вносили на покрытые коллагеном культуральные планшеты 25 см².

Культивирование проводили в инкубаторе при 37 °C, 5% CO₂. В первые 2 суток среду меняли ежедневно для удаления неадгезированных клеток и дебриса, в последующем через 2-3 суток. На 11-е, 15-е и 18-е сутки культивирования клетки снимали трипсином. Часть клеток отбирали для анализа, оставшиеся переносили в планшет, покрытый фибронектином, и далее продолжали культивирование в полной питательной среде до формирования 70% конфлюентной культуры, после чего выполняли пассаж. Визуальный контроль за ростом культуры осуществляли ежедневно. Образцы оценивали методом фазово-контрастной микроскопии на инвертированном микроскопе CarlZeiss.

Проточная цитометрия

Клетки отмывали PBS и окрашивали конъюгированными моноклональными антителами фирмы BioLegend (если не указано иное): флуоресцеин-изотиоцианат (FITC) – (CD34, vWF (abcam); фикоэритрин (PE) – (KDR (BD)); аллоцикоцианин (APC) – (CD133, CD31); фикоэритрин – цианин 7 (PC7) CD146; Krome Orange (KrOr) CD45 (BC).

Пробоподготовка цельной периферической крови, MNF и культуры клеток проводили согласно протоколам фирм-производителей по двум панелям:

1. CD34, KDR, CD146, CD133, CD31, CD45.
2. CD146, vWF.

В пробу вносили от 2 мкл до 20 мкл соответствующих антител с дальнейшей инкубацией 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. Контролем служило внесение в образец равного объема антител соответствующего изотипического контроля, дальнейшую пробоподготовку выполняли аналогично основной пробе. Пробоподготовка крови дополнительно включала этапы лизирования эритроцитов раствором VersaLyse (BC) и отмывки образца PBS. При окрашивании внутриклеточного белка vWF выполняли фиксацию и пермеабилизацию клеток с применением набора IntraPrep (BC). Окрашенные пробы ресуспендировали в PBS и анализировали на проточном лазерном цитометре CytoFlex (США) в программе CytExpert. Настройку прибора для каждой панели выполняли с использованием контрольных проб, окрашенных соответствующими изотипами, дальнейший анализ всех образцов на единых настройках прибора. Для исключения дуплетов клеток и дебриса выделяли целевой гейт по FSC-A и FSC-H с переносом на гистограмму FSC/SSC для последующих этапов гейтирования. Оценивали процент позитивных клеток в популяции для каждого целевого маркера.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Характер распределения в выборках оценивали при помощи критерия Колмогорова–Смирнова. Данные, имеющие нормальное распределение, представлены как среднее и стандартное отклонение, а в случае распределения, отличного от нормального – в виде медианы и квартилей (Ме (Q_0,25-Q_0,75) %). Статистическую значимость различий между двумя независимыми группами в зависимости от характера распределения оценивали с помощью t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна–Уитни. Для проверки простых гипотез использовали критерий ÷² Пирсена с поправкой Йейтса. Достоверными считали различия при уровне значимости р < 0.05.

Результаты и обсуждение

До 8 суток клетки на культуральных планшетах визуально не детектировались. Через 10-18 дней зарегистрировано начало образования колоний с типичной морфологией «булыжной мостовой» (рис. 1А, Б). Пролиферирующие колонии сливались между собой, постепенно вытесняя остальные слабо адгезированные гемопоэтические клетки (рис. 1В).

 

Рисунок 1. Типичный вид культур мононуклеаров периферической крови на 11-е сутки (A), 15-е сутки (Б) и 18-е сутки (В) культивирования (фазово-контрастная микроскопия, об × 5)

Figure 1. Typical appearance of peripheral blood mononuclear cultures on day 11 (A), day 15 (B) and day 18 (C) of culturing (phase-contrast microscopy, vol × 5)

 

Проточная цитометрия культуры детектировала присутствие двух популяций клеток: CD45⁺ и CD45^-. С увеличением суток культивирования количество клеток популяции CD45⁺ снижалось, тогда как количество клеток CD45^- прогрессивно увеличивалось, тем самым вытесняя клетки CD45⁺, популяцию, которая относится к клеткам гемопоэза. К 18-м суткам степень чистоты культуры по CD45^- составляла 97,6% (рис. 2).

 

Рисунок 2. Типичные гистограммы распределения популяций CD45+ и CD45- в культуре в зависимости от суток культивирования: А – 11 суток культивирования; Б – 15 суток культивирования; В – 18 суток культивирования (проточная цитометрия)

Figure 2. Typical histograms of CD45⁺ and CD45^- population distribution in culture depending on the day of cultivation: A, 11 days of cultivation; B, 15 days of cultivation; C, 18 days of cultivation (flow cytometry)

 

Фенотип популяции CD45^- характеризовался максимальной экспессией CD31⁺ (99-100% позитивных клеток), CD144⁺ (99-100% позитивных клеток) и vWF⁺ (89,9-95,5%), присутствием молекул CD34⁺ в 0,1-9,1% клеток и отсутствием линейного гемопоэтического маркера CD45 (табл. 1).

 

Таблица 1. Фенотип популяции CD45^- на различных сроках культивирования (проточная цитометрия)

Table 1. Phenotype of CD45^- population at different culturing times (flow cytometry)

Популяция Population	Время культивирования Cultivation Period	CD34	CD309	CD146	CD133	CD31	vWF
CD45-	7-11-е сут. 7-11 days	0,1 0,0-2,6	83,3 75,0-84,1	93,7 88,9-98,3	0 0,0-0,5	94 93,6-94,4	89,9 85,1-96,5
	13-19 сут. 13-19 days	9,1 1,9-26,7	78,8 61,8-88,7	99,6 97,1-99,9	0 0,0-0,7	99,2 98,4-99,9	95,5 90,7-98,3

 

Заключение

Таким образом, в процессе культивирования мононуклеарной фракции периферической крови была получена популяция клеток CD45^-, которая обладала фенотипом эндотелиальных клеток (CD146⁺CD31⁺CD144⁺CD309⁺v WF⁺CD34^+/-CD133^-). После 10 суток культивирования наблюдалась естественная очистка культуры от гемопоэтических клеток (CD45⁺), к 18-м суткам чистота культуры достигала 96,7%.

Об авторах

Евгения Александровна Торгунакова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»

Автор, ответственный за переписку.
Email: evgeniyatorgunakova@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий

Россия, г. Кемерово

Вера Геннадьевна Матвеева

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»

Email: evgeniyatorgunakova@mail.ru

к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий

Россия, г. Кемерово

Лариса Валерьевна Антонова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»

Email: evgeniyatorgunakova@mail.ru

д.м.н., заведующая лабораторией клеточных технологий

Россия, г. Кемерово

Список литературы

Дополнительные файлы