Isolation of colony-forming cells from human blood and evaluation of population purity by flow cytometry

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Endothelial colony-forming cells (ECFCs) represent a rare population of circulating endothelial progenitor cells (EPCs), which is of interest for tissue engineering, cell therapy, and studying diseorders associated with endothelial dysfunction. Advances in this field imply isolation and pure culturing of endothelial colony-forming cells, which may be obtained from the mononuclear fraction of human peripheral blood. Flow cytometry may provide rather accurate phenotyping and checking purity of the cell cultures. The aim of this study was to obtain a population of colony-forming endothelial cells evaluated by flow cytometry in order to confirm the phenotype and assess the purity of the cell populations. Heparinized donor blood from peripheral vein was used to obtain ECFCs. The mononuclear cell fraction was isolated on a Histopaque 1077 density gradient. The obtained cells were cultured in complete nutrient medium EGM-2 MV with 5% FBS. On the 11th, 15th and 18th days of culture, the cells were detached with trypsin. Some cell aliquots were taken for flow cytometry, and the remaining cells were transferred to a plate for further cultivation until 70% confluency was reached. The phenotype of colonies obtained was evaluated by flow cytometry. Sample preparation of whole peripheral blood, mononuclear fraction and cell culture was performed using two panels of fluorochrome-labeled monoclonal antibodies. Colony growth was visually evaluated by phase-contrast microscopy. Statistical processing of the obtained results was performed using the applied program package “Statistica 6.0”. Up to 9 days, the cell colonies were not detectable visually. During further cultivation, the proliferating colonies of the “cobblestone” type were formed. Two populations were detected by flow cytometry: CD45+ and CD45-. In the course of our study, it was revealed that, with increasing cultivation terms, a decrease of CD45+ population was observed, along with progressive increase of CD45- cells, which may be associated with the gradual displacement of hematopoiesis cells by endothelial colony-forming cells. As a result of our study, the detected CD45+ population had a phenotype of hematopoietic lineage cells, whereas the CD45- population exhibited endothelial phenotype: CD31+CD309+vWF+CD146+. By 18 days, the purity of culture reached 97.6%.

Full Text

Введение

Колониеформирующие эндотелиальные клетки (Endothelial Colony Forming Cells, ECFCs, КФЭК) представляют собой редкую популяцию поздних эндотелиальных клеток-предшественников (EPC), обладающих высоким пролиферативным потенциалом. В отличие от ранних эндотелиальных прогениторных клеток (eEPCs), КФЭК способны непосредственно встраиваться в эндотелиальный слой поврежденных кровеносных сосудов, участвуя в процессе их регенерации. К тому же ранние эндотелиальные прогениторные клетки имеют гемопоэтическое происхождение, тогда как КФЭК считаются гомогенной популяцией истинных эндотелиальных прогениторов [1]. Они экспрессируют эндотелиальные маркеры, такие как CD31, VE-кадгерин, фактор Виллебранда, CD146, VEGFR2, но не экспрессируют гемопоэтические маркеры CD45 и CD14. Эндотелиальные клетки, наряду с их прогениторами, играют важную роль в регуляции иммунного ответа, выступая в качестве активных участников острых или хронических воспалительных процессов, кроме того, они являются фагоцитирующими клетками [2].

КФЭК представляют интерес для многих приложений. КФЭК способны сформировать эндотелиальный монослой, который придаст функциональные свойства, улучшит тромборезистентность и исход имплантации биоинженерных сердечно-сосудистых протезов [3, 4]. Научные исследования подтверждают, что клеточная терапия эндотелиальными прогениторными клетками ишемизированных тканей (например, при ишемической болезни сердца, инсульте и заболеваниях периферических артерий) способна улучшать процессы репарации, активизировать ангиогенез и снизить фиброзирование зоны повреждения [5, 6]. КФЭК могут выступать ценной моделью для изучения процессов ангиогенеза, эндотелиальной дисфункции и функционирования эндотелиального монослоя в норме и при ряде патологических состояний [7]. Реализация этих направлений подразумевает использование чистых культур эндотелиальных колониеформирующих клеток.

Эндотелиальные колониеобразующие клетки могут быть получены из мононуклеарной фракции периферической крови, что подтверждается работами научных групп Medina, Colombo и др. [8, 9]. Проточная цитометрия является методом выбора для определения фенотипа полученной популяции клеток и оценки ее чистоты.

Материалы и методы

Материалом для получения КФЭК служила донорская кровь из периферической вены, забранная с гепарином. Мононуклеарную фракцию (MNF) выделяли на градиенте плотности Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich, США) в соответствии с инструкцией производителя. Полученные из интерфазы клетки дважды промывали избытком PBS с последующим центрифугированием, суспензию клеток ресуспендировали в полной питательной среде EGM-2 MV (Lonza, Швейцария) c 5% FBS (HyСlone, США), 2% пенициллина/стрептомицина (Invitrogen, США) и 0,25 г/мл амфотерицина B (Invitrogen, США) и вносили на покрытые коллагеном культуральные планшеты 25 см2.

Культивирование проводили в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2. В первые 2 суток среду меняли ежедневно для удаления неадгезированных клеток и дебриса, в последующем через 2-3 суток. На 11-е, 15-е и 18-е сутки культивирования клетки снимали трипсином. Часть клеток отбирали для анализа, оставшиеся переносили в планшет, покрытый фибронектином, и далее продолжали культивирование в полной питательной среде до формирования 70% конфлюентной культуры, после чего выполняли пассаж. Визуальный контроль за ростом культуры осуществляли ежедневно. Образцы оценивали методом фазово-контрастной микроскопии на инвертированном микроскопе CarlZeiss.

Проточная цитометрия

Клетки отмывали PBS и окрашивали конъюгированными моноклональными антителами фирмы BioLegend (если не указано иное): флуоресцеин-изотиоцианат (FITC) – (CD34, vWF (abcam); фикоэритрин (PE) – (KDR (BD)); аллоцикоцианин (APC) – (CD133, CD31); фикоэритрин – цианин 7 (PC7) CD146; Krome Orange (KrOr) CD45 (BC).

Пробоподготовка цельной периферической крови, MNF и культуры клеток проводили согласно протоколам фирм-производителей по двум панелям:

  1. CD34, KDR, CD146, CD133, CD31, CD45.
  2. CD146, vWF.

В пробу вносили от 2 мкл до 20 мкл соответствующих антител с дальнейшей инкубацией 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. Контролем служило внесение в образец равного объема антител соответствующего изотипического контроля, дальнейшую пробоподготовку выполняли аналогично основной пробе. Пробоподготовка крови дополнительно включала этапы лизирования эритроцитов раствором VersaLyse (BC) и отмывки образца PBS. При окрашивании внутриклеточного белка vWF выполняли фиксацию и пермеабилизацию клеток с применением набора IntraPrep (BC). Окрашенные пробы ресуспендировали в PBS и анализировали на проточном лазерном цитометре CytoFlex (США) в программе CytExpert. Настройку прибора для каждой панели выполняли с использованием контрольных проб, окрашенных соответствующими изотипами, дальнейший анализ всех образцов на единых настройках прибора. Для исключения дуплетов клеток и дебриса выделяли целевой гейт по FSC-A и FSC-H с переносом на гистограмму FSC/SSC для последующих этапов гейтирования. Оценивали процент позитивных клеток в популяции для каждого целевого маркера.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Характер распределения в выборках оценивали при помощи критерия Колмогорова–Смирнова. Данные, имеющие нормальное распределение, представлены как среднее и стандартное отклонение, а в случае распределения, отличного от нормального – в виде медианы и квартилей (Ме (Q0,25-Q0,75) %). Статистическую значимость различий между двумя независимыми группами в зависимости от характера распределения оценивали с помощью t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна–Уитни. Для проверки простых гипотез использовали критерий ÷2 Пирсена с поправкой Йейтса. Достоверными считали различия при уровне значимости р < 0.05.

Результаты и обсуждение

До 8 суток клетки на культуральных планшетах визуально не детектировались. Через 10-18 дней зарегистрировано начало образования колоний с типичной морфологией «булыжной мостовой» (рис. 1А, Б). Пролиферирующие колонии сливались между собой, постепенно вытесняя остальные слабо адгезированные гемопоэтические клетки (рис. 1В).

 

Рисунок 1. Типичный вид культур мононуклеаров периферической крови на 11-е сутки (A), 15-е сутки (Б) и 18-е сутки (В) культивирования (фазово-контрастная микроскопия, об × 5)

Figure 1. Typical appearance of peripheral blood mononuclear cultures on day 11 (A), day 15 (B) and day 18 (C) of culturing (phase-contrast microscopy, vol × 5)

 

Проточная цитометрия культуры детектировала присутствие двух популяций клеток: CD45+ и CD45-. С увеличением суток культивирования количество клеток популяции CD45+ снижалось, тогда как количество клеток CD45- прогрессивно увеличивалось, тем самым вытесняя клетки CD45+, популяцию, которая относится к клеткам гемопоэза. К 18-м суткам степень чистоты культуры по CD45- составляла 97,6% (рис. 2).

 

Рисунок 2. Типичные гистограммы распределения популяций CD45+ и CD45- в культуре в зависимости от суток культивирования: А – 11 суток культивирования; Б – 15 суток культивирования; В – 18 суток культивирования (проточная цитометрия)

Figure 2. Typical histograms of CD45+ and CD45- population distribution in culture depending on the day of cultivation: A, 11 days of cultivation; B, 15 days of cultivation; C, 18 days of cultivation (flow cytometry)

 

Фенотип популяции CD45- характеризовался максимальной экспессией CD31+ (99-100% позитивных клеток), CD144+ (99-100% позитивных клеток) и vWF+ (89,9-95,5%), присутствием молекул CD34+ в 0,1-9,1% клеток и отсутствием линейного гемопоэтического маркера CD45 (табл. 1).

 

Таблица 1. Фенотип популяции CD45- на различных сроках культивирования (проточная цитометрия)

Table 1. Phenotype of CD45- population at different culturing times (flow cytometry)

Популяция

Population

Время культивирования

Cultivation Period

CD34

CD309

CD146

CD133

CD31

vWF

CD45-

7-11-е сут.

7-11 days

0,1

0,0-2,6

83,3

75,0-84,1

93,7

88,9-98,3

0

0,0-0,5

94

93,6-94,4

89,9

85,1-96,5

13-19 сут.

13-19 days

9,1

1,9-26,7

78,8

61,8-88,7

99,6

97,1-99,9

0

0,0-0,7

99,2

98,4-99,9

95,5

90,7-98,3

 

Заключение

Таким образом, в процессе культивирования мононуклеарной фракции периферической крови была получена популяция клеток CD45-, которая обладала фенотипом эндотелиальных клеток (CD146+CD31+CD144+CD309+v WF+CD34+/-CD133-). После 10 суток культивирования наблюдалась естественная очистка культуры от гемопоэтических клеток (CD45+), к 18-м суткам чистота культуры достигала 96,7%.

×

About the authors

E. A. Torgunakova

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases

Author for correspondence.
Email: evgeniyatorgunakova@mail.ru

Junior Research Associate, Laboratory of Cell Technologies

Russian Federation, Kemerovo

V. G. Matveeva

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases

Email: evgeniyatorgunakova@mail.ru

PhD (Medicine), Senior Research Associate, Laboratory of Cell Technologies

Russian Federation, Kemerovo

L. V. Antonova

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases

Email: evgeniyatorgunakova@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Head, Laboratory of Cell Technologies

Russian Federation, Kemerovo

References

  1. Banno K., Yoder M.C. Tissue regeneration using endothelial colony-forming cells: promising cells for vascular repair. Pediatr. Res., 2018, Vol 83, no. 1-2, pp. 283-290.
  2. Colombo E., Calcaterra F., Cappelletti M., Mavilio D., Della Bella S. Comparison of fibronectin and collagen in supporting the isolation and expansion of endothelial progenitor cells from human adult peripheral blood. PloS One, 2013, Vol. 8, no. 6, e66734. doi: 10.1371/journal.pone.0066734.
  3. Go E., Yoder M.C. Identification of endothelial cells and their progenitors. Methods Mol. Biol., 2021, no. 2206, pp. 27-37.
  4. Lin Y., Weisdorf D.J., Solovey A., Hebbel R.P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest., 2000, Vol. 105, no. 1, pp. 71-77.
  5. Medina R.J., Barber C.L., Sabatier F., Dignat-George F., Melero-Martin J.M., Khosrotehrani K., Ohneda O., Randi A.M., Chan J.K.Y., Yamaguchi T., van Hinsbergh V.W.M., Yoder M.C., Stitt A.W. Endothelial progenitors: a consensus statement on nomenclature. Stem Cells Transl. Med., 2017, Vol. 6, no. 5, pp. 1316-1320.
  6. Medina R.J., O’Neill C.L., Sweeney M., Guduric-Fuchs J., Gardiner T.A., Simpson D.A., Stitt A.W. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Med. Genomics, 2010, Vol, 3, 18. doi: 10.1186/1755-8794-3-18.
  7. Melero-Martin J.M., Khan Z.A., Picard A., Wu X., Paruchuri S., Bischoff J. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood, 2007, Vol. 109, no. 11, pp. 4761-4768.
  8. Moubarik C., Guillet B., Youssef B., Codaccioni J.L., Piercecchi M.D., Sabatier F., Lionel P., Dou L., Foucault-Bertaud A., Velly L., Dignat-George F., Pisano P. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Rev. Rep., 2011, Vol. 7, no. 1, pp. 208-220.
  9. Pober J.S., Sessa W.C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol., 2007, Vol. 7, no. 10, pp. 803-815.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
2. Figure 1. Typical appearance of peripheral blood mononuclear cultures on day 11 (A), day 15 (B) and day 18 (C) of culturing (phase-contrast microscopy, vol × 5)

Download (633KB)
3. Figure 2. Typical histograms of CD45+ and CD45- population distribution in culture depending on the day of cultivation: A, 11 days of cultivation; B, 15 days of cultivation; C, 18 days of cultivation (flow cytometry)

Download (494KB)

Copyright (c) 2024 Torgunakova E.A., Matveeva V.G., Antonova L.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies