APPLICATION OF A BIOFLUORESCENT STRAIN OF YERSINIA PESTIS AND FLOW CYTOMETRY TO ASSESS THE PHAGOCYTIC ACTIVITY OF BLOOD LEUKOCYTES IN AN IN VITRO TEST

Резюме

Фагоцитарная активность (ФА) лейкоцитов крови по отношению к Yersinia pestis отражает состояние клеточного противочумного иммунитета у людей и лабораторных животных. Целью настоящей работы явилась оценка стимулирующего эффекта противочумной вакцинации на ФА лейкоцитов периферической крови в тесте in vitro c использованием проточной цитометрии и биофлуоресцентного штамма Y. pestis EV НИИЭГpTurboGFP-B (КМ2115), экспрессирующего зеленый флуоресцирующий белок GFP. Материалы и методы. Исследовали лейкоциты в 100 мкл цельной гепаринизированной крови мышей, морских свинок и людей, привитых и не привитых живой чумной вакциной. Фагоцитарную реакцию моделировали путем добавления  живых клеток штамма КМ2115 в кровь, разведенную физиологическим раствором, и результат учитывали через 15 мин методом проточной цитометрии, определяя в гейте гранулоцитов долю активных фагоцитов, обладающих интенсивной флуоресценцией в зеленой области спектра. Анализ проводили согласно протоколу, разработанному нами ранее в опытах с убитым чумным микробом, меченым красителем ФИТЦ. Результаты. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие о возможности  использования биофлуоресцентного штамма Y. pestis для быстрого определения ФА гранулоцитов методом проточной цитометрии в микрообъемах цельной крови человека и животных без длительного предварительного окрашивания микроба флуоресцирующим красителем. Для клеток крови привитых против чумы людей и животных зарегистрированы повышенные значения фагоцитарных индексов, что согласуется с данными о стимулирующем эффекте противочумной вакцинации на фагоцитарную функцию лейкоцитов. По данным проточной цитометрии, активные фагоциты крови мышей контрольной группы флуоресцировали в зеленой области спектра после контакта in vitro c живыми клетками штамма КМ 2115 интенсивнее фагоцитов морских свинок и человека, что могло быть связано с видовой особенностью состава мышиных лейкоцитарных протеаз и, как следствие, с повышенной экспрессией белка GFP в бактериях, поглощенных мышиными фагоцитами. Заключение. Применение биофлуоресцентного штамма упрощает процедуру моделирования взаимодействия клеток макроорганизма с чумным микробом и последующую оценку ФА нейтрофилов в образцах цельной периферической крови, что может быть использовано для характеристики напряженности клеточного поствакцинального противочумного иммунитета в тесте in vitro.