Usage of a biofluorescent  Yersinia pestis  strain and flow cytometry to assess phagocytic activity of blood leukocytes in an  in vitro  test

A. L. Kravtsov; Кравцов А. Л.; A. A. Budanova; Буданова А. А.; Svetlana N. Klyueva; Клюева Светлана Николаевна; V. A. Kozhevnikov; Кожевников В. А.; S. A. Bugorkova; Бугоркова С. А.

doi:10.46235/1028-7221-17010-UOA

Usage of a biofluorescent Yersinia pestis strain and flow cytometry to assess phagocytic activity of blood leukocytes in an in vitro test

Authors: Kravtsov A.L.¹, Budanova A.A.¹, Klyueva S.N.¹, Kozhevnikov V.A.¹, Bugorkova S.A.¹
Affiliations:
1. Russian Anti-Plague Institute “Microbe”
Issue: Vol 29, No 2 (2026)
Pages: 373-380
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 08.07.2024
Accepted: 24.07.2025
Published: 22.04.2026
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/17010
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-17010-UOA
ID: 17010

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Phagocytic activity (PA) of blood leukocytes for Yersinia pestis reflects the state of cellular anti-plague immunity in humans and laboratory animals. The purpose of this work was to evaluate the stimulatory effect of anti-plague vaccination on the PA of peripheral blood leukocytes by in vitro assay using flow cytometry and a biofluorescent strain of Y. pestis EV NIIEG pTurboGFP-B (KM2115), expressing the green fluorescent protein (GFP). We studied leukocytes the 100-μL samples of heparinized whole blood of mice, guinea pigs and humans that were vaccinated with live plague vaccine, as compared with non-vaccinated controls. The suspensions of living KM2115 cells were mixed to blood samples diluted with physiological solution. The result of the phagocytic reaction was assessed after 15 minutes by flow cytometry thus determining the proportion of active phagocytes in the granulocyte gate that showed intense fluorescence in the green area of the spectrum. The data analysis was carried out by the previously developed protocol based on experiments with killed plague microbes labeled with FITC dye. The obtained experimental data have suggested an opportunity of using a biofluorescent Y. pestis strain for the rapid determination of granulocyte PA by flow cytometry in microvolumes of whole blood from humans and animals without longer preliminary staining of microbes with a fluorescent dye. Increased values of phagocytic indices were registered for blood cells of people and animals vaccinated against plague, thus being consistent with data on the stimulatory effect of anti-plague vaccination on the phagocytic function of leukocytes. The use of a biofluorescent strain has simplified the procedure for modeling the interaction of macroorganism cells with plague microbes and subsequent assessment of neutrophil PA in whole peripheral blood, thus enabling its usage to characterize the magnitude of post-vaccination anti-plague immune response by an in vitro test.

Keywords

Yersinia pestis, blood leukocytes, phagocytic activity, green fluorescent protein, flow cytometry, cell immunity, in vitro test

Full Text

Введение

Фагоцитоз при бактериальных инфекциях является основой клеточного иммунитета, определяющей исход инфекционного процесса, в том числе и при чуме [12, 13]. Показатели фагоцитарной реакции при чуме традиционно оцениваются in vitro на моделях макрофагов лабораторных животных [7, 13], а взаимодействие возбудителя чумы с фагоцитами крови (нейтрофилами) до сих пор остается мало изученным [8, 12]. В то же время у людей именно лейкоциты крови являются основным исследуемым объектом при определении активности фагоцитоза как показателя клеточного поствакцинального антибактериального иммунитета [9, 10]. У циркулирующих в крови нейтрофильных гранулоцитов (НГ) может быть два четко различимых функциональных состояния: исходное, так называемое redox, с низким уровнем протекания функциональных процессов, и активированное, переход в которое обусловлен стимуляцией, индуцируемой бактериями, микробными антигенами (например, липополисахаридами) или аллергенами. При таком переходе, получившем название прайминга (priming – подготовка к работе), на поверхности фагоцитов повышается плотность экспрессии Fc-рецепторов, взаимодействуя с которыми молекулы специфических IgG-антител, входящие в состав формируемых в крови иммунных комплексов, стимулируют поглотительную и бактерицидную функцию НГ при киллинге бактерий [11].

Хотя прайминг, индуцируемый противочумной вакцинацией, существенно повышает функциональный потенциал фагоцитов при повторном взаимодействии иммунного организма с чумным микробом и его антигенами [1, 12], методы, оценивающие in vitro фагоцитарную активность (ФА) лейкоцитов периферической крови, пока не применяются для характеристики состояния поствакцинального клеточного противочумного иммунитета. В единичных публикациях, посвященных вопросам изучения взаимодействия Yersinia pestis с фагоцитами крови человека, используются нейтрофилы, предварительно выделенные из периферической крови с помощью градиентного центрифугирования. Результаты фагоцитарной реакции учитываются c помощью микроскопии либо микробиологическим методом по интенсивности развивающегося in vitro бактерицидного эффекта [8, 14]. Однако нельзя утверждать, что регистрируемый микробиологическим методом бактерицидный эффект связан именно с фагоцитозом, поскольку кроме фагоцитоза НГ периферической крови используют для киллинга бактерий другие, не менее эффективные стратегии бактерицидности – нетоз и секреторную дегрануляцию [12]. Микроскопический метод учета показателей фагоцитарной реакции длителен, трудоемок и, главное, не дает объективной количественной информации, что является основной причиной, ограничивающей его практическое применение. Перспективу решения проблемы связывают с более широким внедрением в практику иммунологических исследований проточно-цитометрической технологии, имеющей при оценке показателей фагоцитоза такие очевидные преимущества, как скорость, объективность анализа и простота постановки реакции [9, 10].

Ранее нами был разработан метод оценки ФА лейкоцитов крови с использованием проточной цитометрии и убитых нагреванием клеток Y. pestis, включающий процедуру предварительной подготовки микробных взвесей, окрашенных по белку флуоресцирующим красителем ФИТЦ. В исследованиях in vitro с клетками крови человека и животных c его помощью были получены экспериментальные данные о возможности регистрации и оценки стимулирующего эффекта противочумной вакцинации на поглотительную функцию фагоцитов по отношению к убитым клеткам чумного микроба [2, 3]. Анализ литературы свидетельствует, что параметры фагоцитарной реакции можно учитывать в опытах с биофлуоресцентными штаммами Y. pestis, экспрессирующими флуоресцентные белки. В качестве модельных такие штаммы применялись в экспериментах in vitro с макрофагами [7], нейтрофилами мышей in vivo [12] и клетками простейших (почвенные амебы, нематоды) [4]. Однако в тесте in vitro для определения ФА нейтрофилов методом проточной цитометрии, не требующим предварительного выделения фагоцитов из цельной периферической крови человека и животных [3], биофлуоресцентные штаммы ранее не применялись. Такой анализ не использовался для сравнительной оценки ФА лейкоцитов крови привитых и не привитых против чумы лиц.

Целью настоящей работы была оценка возможности определения стимулирующего эффекта противочумной вакцинации на ФА лейкоцитов периферической крови в тесте in vitro с использованием биофлуоресцентного штамма и проточной цитометрии.

Материалы и методы

В работе использовали исходный вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ и полученный из этого штамма рекомбинантный биофлуоресцентный штамм Y. pestis EV НИИЭГ pTurboGFP-B (pFra⁺ pCad⁺ pPst⁺ pTurboGFP-B), депонированный под номером KM2115 в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН «Российский противочумный институт “Микроб”» Роспотребнадзора. Биофлуоресцентный штамм, содержащий векторную плазмиду pTurboGFP-B, кодирующую синтез зеленого флуоресцирующего белка GFP, выращивали, как и исходный его вариант, на агаре LB (рН 7,2) в течение 48 ч при 28 °С, но добавляя в среду 50 мг/мл ампициллина. По стандарту мутности ОСО из двухсуточных агаровых культур готовили в физиологическом растворе (рН 7,2) взвеси живых бактерий с концентрацией 2 × 10⁹ КОЕ для иммунизации лабораторных животных (штамм EV) и опытов in vitro c лейкоцитами периферической крови (штамм КМ2115).

Экспериментальными моделями служили беспородные морские свинки массой 250-300 г и мыши линии BALB/c массой 18-20 г, полученные из отдела экспериментальных животных с виварием ФКУН «Российский противочумный институт “Микроб”» Роспотребнадзора. Всего в исследованиях было использовано по 12 животных каждого вида, разделенных на две равные группы – опытную и контрольную. Мышей и морских свинок опытных групп подкожно иммунизировали иммуногенной дозой штамма Y. pestis EV НИИЭГ: 2,5 × 10⁴м. к. и 5 × 10³ м. к. соответственно. ФА оценивали на 21-e сутки иммуногенеза – в период формирования у биомоделей наиболее напряженного противочумного иммунитета. Иммунологическую перестройку в организме привитых против чумы животных подтверждали определением в крови титров специфических антител к капсульному антигену чумного микроба с помощью иммуноферментной тест-системы «ИФА-АТ-Ф1 Yersinia pestis», производства ФКУН «Российский противочумный институт “Микроб”» Роспотребнадзора [5]. Для цитометрических исследований от каждого из животных в опытной и контрольной группах собирали в пробирки с антикоагулянтом (гепарином) кровь: у мышей – путем декапитации; у морских свинок – из сердца с помощью шприца на фоне анестезии. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с законодательством Российской Федерации, программа экспериментальных работ была одобрена Комиссией по биоэтике при ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт “Микроб”» Роспотребнадзора (протокол № 5 от 25.05.2023). Кроме того, в опытах с биофлуоресцентным штаммом чумного микроба использовали для оценки и сравнения показателей ФА лейкоцитов гепаринизированную кровь никогда не прививавшихся против чумы людей (группа сравнения, n = 3) и кровь лиц, неоднократно привитых живой чумной вакциной (группа наблюдения, n = 5). У всех участников исследования забор крови из локтевой вены в пробирки с гепарином проводили на основании должным образом оформленного добровольного информированного согласия. Полученные образцы крови использовали в течение 2 ч после забора крови.

ФА гранулоцитов по отношению к живым клеткам биофлуоресцентного штамма Y. pestis КМ2115 определяли в микрообъемах цельной крови человека и лабораторных животных цитофлуориметрическим методом, подробно описанным нами ранее [2, 3]. Применяли тот же протокол цитофлуориметрического анализа для идентификации и подсчета в гейте гранулоцитов крови активных фагоцитов, «загруженных» бактериями, флуоресцирующими в зеленой области спектра. Отличие методики заключалось в том, что регистрировали не зеленую флуоресценцию красителя ФИТЦ, адсорбированного убитыми микробными клетками, а зеленую биофлуоресценцию белка GFP, экспрессируемого живыми клетками чумного микроба.

Полученные экспериментальные данные статистически обрабатывали с использованием стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2016, Statistica 10.0 (StatSoft Inc.), представляя результаты в виде медианы (Me) и квартильных отклонений (Q_0,25-Q_0,75) с расчетом достоверности различий в исследуемых группах с использованием U-критерия Манна–Уитни. Значение р < 0,05 считали статистически значимым.

Результаты и обсуждение

В суммарной популяции лейкоцитов каждого исследуемого образца крови гранулоциты автоматически дифференцировали от мононуклеаров по показателям малоуглового и бокового светорассеяния (по размеру и степени внутриклеточной гранулярности соответственно), чтобы в гейте гранулоцитов можно было регистрировать флуоресценцию, приобретаемую активными фагоцитами после поглощения ими in vitro микробных клеток, обладающих свечением в зеленой области спектра [2, 3]. Результаты такой регистрации наглядно представлены на рисунке 1 для фагоцитов крови двух используемых в работе биомоделей в виде характерных распределений больших статистических выборок отдельных клеток по интенсивности зеленой флуоресценции. Все активные фагоциты, поглотившие бактерии и обладающие интенсивной флуоресценцией, учитывались по уровню свечения в выделенном на каждой гистограмме регионе R2. Видно, что проточно-цитометрический анализ позволяет четко дифференцировать неактивные мышиные фагоциты крови с очень слабым собственным фоновым свечением (менее 10 условных единиц каналов) от 47,5% активных клеток, которые у не привитого против чумы животного характеризовались средним уровнем зеленого свечения на клетку (Mean), равным 1577 у. e. Противочумная вакцинация стимулировала ФА гранулоцитов крови мышей, как по фагоцитарному индексу (число активных фагоцитов повышалось в 1,4 раза – до 66,0%), так и по фагоцитарным числам, определяющим интенсивность клеточной флуоресценции (повышение Mean после прививки до 3986 у. е. – в 2,5 раза). У морских свинок отмечали иной характер стимуляции фагоцитоза под влиянием противочумной вакцинации, проявившийся в существенном повышении фагоцитарного индекса – в 4,4 раза (с 10,6% до 46,8%). При этом в опытной группе вакцинированных морских свинок отсутствовали, в отличие от мышей, изменения, связанные с повышением интенсивности зеленой флуоресценции отдельных активных фагоцитов.

Рисунок 1. Гистограммы, отражающие стимулирующее воздействие противочумной вакцинации на фагоцитоз биофлуоресцентного штамма КМ2115 чумного микроба гранулоцитами крови лабораторных животных

Примечание. Результаты учитывали через 15 мин после добавления флуоресцирующих бактерий к лейкоцитам цельной периферической крови. Регион R2 соответствует активным фагоцитам. Численные значения показателей (% Hist) и (Mean) для региона R2 под каждой гистограммой – это фагоцитарные индексы (%) и средние значения фагоцитарных чисел в условных единицах интенсивности флуоресценции.

Figure 1. Histograms reflecting the stimulating effect of anti-plague vaccination on phagocytosis of the biofluorescent strain KM2115 of the plague microbe by blood granulocytes of laboratory animals

Note. The results were taken into account 15 minutes after the addition of bacteria to leukocytes of whole peripheral blood. Region R2 corresponds to active phagocytes. The numerical values of the indicators (% Hist) and (Mean) for the R2 region under each histogram are the phagocytic indices (%) and the average values of the phagocytic numbers in arbitrary units of fluorescence intensity.

Статистически обработанные экспериментальные данные, полученные в опытах с лейкоцитами крови двух видов животных, представлены нами в таблице 1 вместе с результатами анализа лейкоцитов крови людей, полученными в аналогичных условиях. В группе привитых против чумы доноров, как и у вакцинированных животных, были зарегистрированы более высокие значения фагоцитарных индексов для популяции гранулоцитов периферической крови. Стимулирующий эффект противочумной вакцинации на ФА лейкоцитов крови человека по отношению к чумному микробу имел, по исследуемым показателям, большее сходство с эффектом, характерным для морских свинок, чем для мышей. Кроме того, из сравнения представленных в таблице данных следует, что активные фагоциты крови мышей контрольной группы флуоресцировали в зеленой области спектра после контакта in vitro c живыми клетками биофлуоресцентного штамма КМ2115 в 20 раз интенсивнее фагоцитов крови морских свинок и в 40 раз интенсивнее фагоцитов крови людей.

Таблица 1. Влияние противочумной вакцинации на фагоцитоз штамма Y. pestis КМ2115 лейкоцитами крови мышей, морских свинок и человека

Table 1. Effect of anti-plague vaccination on phagocytosis of Y. pestis strain KM2115 by blood leukocytes of mice, guinea pigs and humans

Объект исследования

Object of study

Фагоцитарные индексы, %

Phagocytic indices, %

Фагоцитарные числа в у. е. интенсивности флуоресценции

Phagocytic number in arbitrary units of fluorescence intensity

Вак

Vac

Не Вак

No Vac

Вак

Vac

Не Вак

No Vac

Кровь мыши

Mice blood

62,3

(42,9-73,4)*

37,2

(31,9-42,6)

3750

(2992-5682)*

2563

(1473-3153)

Кровь морской свинки

Guinea pig blood

30,6

(19,5-47,9)*

11,3

(10,0-16,2)

105

(93-135)

128

(83-194)

Кровь

человека

Human blood

73,7

(61,2-81,4)*

50,4

(40,4-58,6)

(5-85)

(53-91)

Примечание. Вак – вакцинированные, Не Вак – невакцинированные. * – достоверные различия с контролем (p < 0,05).

Note. Vac, vaccinated; No Vac, not vaccinated. *, significant differences with control (p < 0.05).

Причина столь выраженных видовых различий пока неясна. Необходимы дополнительные исследования, поскольку маловероятно, что мышиные нейтрофилы поглощали при фагоцитозе в 40 раз больше живых бактерий, чем нейтрофилы человека. Вероятно, такие отличия обусловлены у мышей составом и субстратной специфичностью лейкоцитарных протеаз, играющих ведущую роль в обеспечении деструкции бактериальных белков. У мышей самый высокий уровень дефицита в фагоцитах крови лейкоцитарной эластазы (основной протеазы лейкоцитов крови человека) [6], ответственной, как известно, за быструю избирательную деструкцию факторов вирулентности Yersinia spp. и других энтеробактерий [15]. Именно набором лейкоцитарных протеаз мыши принципиально отличаются от человека. Возможно, поэтому обнадеживающие результаты тестирования разрабатываемых противочумных вакцин на мышах не всегда оказываются столь убедительно показательными на других биомоделях и для людей [14]. Все это лишний раз демонстрирует важность адекватного подбора биомодели и метода оценки того или иного показателя для конкретных задач исследования при разработке средств специфической профилактики чумы.

Заключение

Таким образом, применение биофлуоресцентного штамма КМ2115 и проточной цитофлуориметрии упрощает процедуру моделирования взаимодействия фагоцитов крови с чумным микробом in vitro и последующую оценку стимулирующего эффекта противочумной вакцинации на ФА лейкоцитов крови биомодели и человека.