Полиморфизм генов цитокинов и их связь с уровнем продукции и эффективностью лечения больных туберкулезом легких в фазе продолжения

Полный текст

Введение

На данный момент исследования в области иммуногенетики туберкулеза, как и других болезней [1], считаются одними из ключевых направлений из-за того, что эффективность лечения и исход болезни в большинстве случаев зависят от иммунологических и генетических особенностей организма. Особое внимание следует уделить значению IL-10 в развитии защитного иммунитета против туберкулеза [2, 3].

Необходимо подчеркнуть существенную функцию IL-10 в развитии иммунитета против туберкулеза. Известно, что этот цитокин сдерживает активацию макрофагов [4, 7]. В период туберкулезной инфекции IL-10 продуцируется макрофагами легких и дендритными клетками [5, 6].

В настоящее время существуют противоречивые данные о влиянии IL-10 на формирование иммунитета у пациентов с туберкулезом легких, что отражено в нескольких исследованиях. Например, Л.Г. Тарасова и коллеги связывают повышенную концентрацию IL-10 с обширными деструктивными процессами в легочной ткани [5], в то время как D. Higgins и соавт. демонстрируют его ключевую роль в защите от хронического воспаления легких [9].

Таким образом, изучение взаимосвязи между полиморфизмами генов цитокинов и их продукцией, а также оценка влияния этих факторов на эффективность противотуберкулезной терапии представляются перспективными. Блокирование цитокинов может стать потенциальной стратегией в разработке адъювантной иммунотерапии, особенно для случаев, связанных с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя – микобактерии туберкулеза (МБТ).

В рамках данного исследования была поставлена задача изучить связь между полиморфизмами генов цитокинов (IL1β, IL4, IL10, TNF), уровнем их экспрессии и эффективностью лечения антибактериальной терапии (химиотерапии) в фазе продолжения.

Материалы и методы

Группа исследования представлена 100 больными, страдающими туберкулезом легких (впервые выявленный туберкулез легких – 60 человек, туберкулез легких с хроническим течением – 40 человек) в возрасте от 18 до 65 лет, получивших химиотерапию в интенсивной и фазе продолжении (т. е. закончивших основной курс лечения в рекомендованные сроки согласно Приказа Минздрава РФ от 29 декабря 2014 г. № 951 «Об утверждении методических рекомендаций по совершенствованию диагностики и лечения туберкулеза органов дыхания»). Критериями исключения из исследования явились – пациенты с тяжелыми сопутствующими заболеваниями (злокачественные новообразования, системные заболевания кровеносной системы, сердечно-легочная и почечная недостаточность в стадии декомпенсации, резкое истощение, анемия, тиреотоксикоз, психические заболевания).

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации, использовали общепринятые во фтизиатрии методы и алгоритмы исследования в соответствии с приказом Минздрава РФ от 29 декабря 2014 г. № 951 «Об утверждении методических рекомендаций по совершенствованию диагностики и лечения туберкулеза органов дыхания».

В исследовании преобладали лица мужского пола, 82 человека – 76,7%. Средний возраст пациентов, включенных в исследование, составляет 46,3 года.

В группе исследования преобладали больные с инфильтративным (ИТЛ) и диссеминированным (ДТЛ) туберкулезом легких – в 37,0% и 31,0% соответственно. Фиброзно-кавернозную форму (ФКТЛ) диагностировали в 18,0%, а очаговую форму туберкулеза легких (ОТЛ) определяли в 14,0% случаев. В группе наблюдения рассматривали отдельно подгруппы больных, в зависимости от наличия у них определяемых лучевыми методами деструктивных изменений (фазы распада), с тяжелым и легким течением. Критерия эффективности лечения больных туберкулезом легких явились: исчезновение клинических и лабораторных признаков туберкулезного воспаления, стойкое прекращение бактериовыделения, подтвержденное микроскопическими и культуральными исследованиями, регрессия рентгенологических проявлений туберкулеза (очаговых, инфильтративных, деструктивных), а также восстановление функциональных возможностей организма больных и их трудоспособности.

Контрольная группа формировалась в ходе профилактических осмотров на предприятиях и государственных учреждениях, а также в стационарах ЛПУ г. Курска, не имеющих хронической патологии других органов и систем. Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике КГМА-филиала ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России (выписка из Протокола № 04/05 заседания Комитета по этике от 27.05.2021 года). Все пациенты подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании.

У всех обследуемых пациентов, включенных в исследование, проводился забор венозной крови для проведения молекулярно-генетических методов исследования. Геномную ДНК выделяли стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Генотипирование полиморфизмов (rs l6944) гена IL1, (rs2243250) гена IL4 (rsl800795) гена IL6 (rs l800896) гена IL-10 проводилось методом ПЦР в режиме реального времени путем дискриминации аллелей с помощью Taq Man-зондов на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США) с использованием протоколов, опубликованных в литературе [8]. Постановка полимеразной цепной реакции в режиме реального времени производилась с использованием наборов реагентов для генотипирования SNPs: -31T>C (rs1143627) IL1β, -589C/T (rs2243250) IL4, -592C/A (rs1800872) и -1082A/G (rs1800896) IL10 и -308G>A (rs1800629) TNF. Для проверки качества генотипирования 10% проб было выбрано случайным образом с целью повторного генотипирования, полученные результаты не отличались от первоначальных.

Для определения концентрации цитокинов (IL-1β, IL-4, IL-6, TNF, IFNγ, IL-10) в сыворотке крови использовалась взятая натощак из локтевой вены кровь, в стерильных условиях в количестве 5 мл. Образцы крови центрифугировались со скоростью 3500-4000 об/мин в течение 10 минут, затем сыворотку аликвотировали и замораживали при температуре ниже – 20 °С и хранили от 1 до 4 месяцев без повторных циклов размораживания и оттаивания. Непосредственно перед анализом все исследуемые сыворотки и компоненты тест-системы прогревались при комнатной температуре. Иммуноферментный анализ выполнялся с помощью наборов реактивов (АО «Вектор-Бест», Россия) строго по протоколу исследования, предложенному фирмой-производителем.

Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием программных пакетов SPSS Statistica 26, которая включала в себя проверку данных на нормальность распределения (критерий Колмогорова–Смирнова), непараметрический критерий корреляции Спирмена, критерий Уилкоксона (Вилкоксона) для связанных выборок, для сравнения качественных признаков использовался критерий хи-квадрат Пирсона.

Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди–Вайнберга использовали критерий ÷² Пирсона.

Результаты и обсуждение

В ходе проведения фазы продолжения отмечалось снижение уровня IL-4 у больных туберкулезом легких с генотипом IL4-589CC на 15,9% (базовый уровень IL-4 – 16,5 пг/мл, Сl_25-75 – 11,9-20,1, р < 0,0001; уровень IL-4 после проведения химиотерапии – 14,01 пг/ мл; Сl_25-75 – 11,1-17,5, р < 0,0001), а с генотипом IL4-589CT+TT – на 16,1% (базовый уровень IL-4 – 13,48 пг/мл, Сl_25-75 – 9,9-16,3, р < 0,0001; уровень IL-4 после проведения химиотерапии – 11,3 пг/мл; Сl_25-75 – 8,7-12,8, р < 0,0001) (табл. 1).

 

Таблица 1. Динамика уровня цитокинов в зависимости от полиморфизма генов цитокинов в процессе проведения фазы продолжения у больных туберкулезом легких

Table 1. Dynamics of level of cytokines depending on polymorphism of genes of cytokines in the course of carrying out a phase of continuation at suffering from tuberculosis lungs

Генотипы Genotypes	N	Базовый уровень цитокинов, медиана (пг/мл) Basic level of cytokines, median (pg/mL)	Интерквартильный размах до проведения интенсивной фазы химиотерапии (пг/мл) Interquartile scope before carrying out an intensive phase of chemotherapy (pg/mL)	Уровень цитокинов после завершения интенсивной фазы химиотерапии, медиана (пг/мл) Level of cytokines after end of an intensive phase of chemotherapy, a median (pg/mL)	Интерквартильный размах (пг/мл) после проведения интенсивной фазы химиотерапии (пг/мл) Interquartile scope (pg/mL) after carrying out an intensive phase of chemotherapy (pg/mL)	Изменение уровня цитокинов относительно базального уровня (%) Change of level of cytokines of rather basal level (%)	Контрольная группа (пг/мл) Control group (pg/mL)	р
IL4
IL4-589CC	29	16,5	11,9-20,1	14,01	11,1-17,5	-15,9	0,35	< 0,0001
IL4-589CT+TT	59	13,48	9,9-16,3	11,3	8,7-12,8	-16,1	0,3	< 0,0001
IL – TNF
TNF-308GG	76	6,6	3,8-8,4	5,6	3,4-6,8	-15,1	7,33	0,0001
TNF-308GA	12	6,5	3,5-8,4	5,7	4,2-6,8	-12,3	7,3	0,308
IL-10
IL10-592CC	83	35,6	31,6-41,2	29,9	24,6-35,0	-15,9	5,3	< 0,0001
IL10-592CA+AA	5	37,8	31,4-42,5	34,5	30,7-39,2	-8,5	5,5	< 0,345
IL – IFNγ
IL10-1082AA	4	6,6	6,07-7,20	6,65	5,24-7,96	+0,75	5,7	1,0
IL10-1082AG+GG	84	5,4	5,25-6,80	5,95	4,92-7,60	+10,1	5,2	< 0,0001

 

У больных туберкулезом легких с генотипом TNF-308GG отмечалось снижение уровня TNF на 15,1% (базовый уровень TNFα – 6,6 пг/мл, Сl_25-75 – 3,8-8,4, р = 0,0001; уровень TNFα после проведения специфической химиотерапии – 5,6 пг/ мл; Сl_25-75 – 3,4-6,8, р < 0,0001), в то время как у больных туберкулезом легких с генотипом TNF-308GA отмечалось снижение уровня TNF на 12,3% (базовый уровень TNFα – 6,5 пг/мл Сl_25-75 – 3,5-8,4, р = 0,308; уровень TNF после проведения специфической химиотерапии – 5,7 пг/ мл; Сl_25-75 – 4,2-6,8, р = 0,308) (табл. 1).

У больных туберкулезом легких с генотипом IL10-592CC отмечалось снижение уровня IL-10 на 15,9% (базовый уровень IL-10 – 35,6 пг/ мл, Сl_25-75 – 31,6-41,2, р < 0,0001; уровень IL-10 после проведения специфической химиотерапии – 29,9 пг/ мл; Сl_25-75 – 24,6-35,0, р < 0,0001), в то время как у больных туберкулезом легких с генотипом IL10-592CA+AA также отмечалось снижение уровня IL-10 на 8,5% (базовый уровень IL- 10 – 37,8 пг/мл, Сl_25-75 – 31,4-42,5, р < 0,0001; уровень IL-10 после проведения специфической химиотерапии – 34,5 пг/мл; Сl_25-75 – 30,7-39,2, р = 0,345) (табл. 1).

У больных туберкулезом легких с генотипом IL10 -1082АА отмечалось снижение уровня IL- 10 на 6,6% (базовый уровень IFNγ – 6,6 пг/ мл, Сl_{25- 75} – 6,07-7,2, р = 1,0; уровень IFNγ после проведения специфической химиотерапии – 6,65 пг/ мл; Сl_25-75 – 5,24-7,96, р = 1,0), в то время как, у больных туберкулезом легких с генотипом IL10 -1082АG+GG также отмечалось увеличение уровня IFNγ на 10,1% (базовый уровень IFNγ – 5,4 пг/мл, Сl_25-75 – 5,25-6,8, р < 0,0001; уровень IFNγ после проведения специфической химиотерапии – 5,95 пг/мл; Сl_25-75 – 4,92-7,6, р < 0,0001) (табл. 1).

В настоящем исследовании была также проанализирована эффективность лечения в фазе продолжения в зависимости от полиморфизма генов IL4-589 и IL10-592 (рис. 1).

 

Рисунок 1. Эффективность фазы продолжения в зависимости от генотипов цитокинов

Figure 1. Effectiveness of the continuation phase depending on the genotypes of cytokines

 

Показано, что эффективность лечения в этой фазе химиотерапии в 34,0% (р = 0,01) случаев связана с генотипом IL4-589CC, в 57,0% случаев (р = 0,01) – с генотипом IL4-589CT+TT, в 84,0% (р = 0,57) случаев – с генотипом IL10-592CC, в 7,0% (р = 0,57) случаев – с генотипом IL10-592CТ+ТТ, в то время как неэффективная фаза химиотерапии связана в 5,0% (р = 0,01) случаев с генотипом IL4-589CC, в 3,0% (р = 0,01) случаев – с генотипом IL4-589CT+TT, в 10,0% (р = 0,57) с генотипом IL10-592CC, в 0% случаев с генотипом IL10-592CА+АА (р = 0,57) (рис. 1).

При проведении химиотерапии наблюдаемых больных туберкулезом легких, обладающих генотипом IL4-589CC, было зафиксировано более неблагоприятное развитие болезни на этапе продолжения лечения по сравнению с теми, кто имеет генотип IL4-589CT+TT. У лиц с генотипом IL10-592CA+AA также наблюдалось менее благоприятное течение болезни в интенсивной фазе терапии по сравнению с пациентами, у которых генотип IL10-592CC.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что эффективность лечения больного с различными вариантами течения заболевания туберкулезом (тяжелое с деструктивными изменениями и легкое без таких изменений) была разной и связана с генотипами IL4 и IL10, при которых продукция цитокинов, предопределяющих в определенной степени эффективность лечения, была различной. Отсюда очевидно, что процесс взаимодействия между микроорганизмами (возбудители туберкулеза) и макроорганизмами (больной туберкулезом) в случае туберкулезной инфекции представляет собой довольно сложный процесс, задействующий множество элементов иммунной системы. Взаимодействие компонентов этой системы управляется посредством цитокинов – медиаторов клеточного взаимодействия.

С учетом результатов исследования, в перспективе с практической точки зрения данные генетического тестирования полиморфизмов генов возможно целесообразным рекомендовать при лечении больных туберкулезом применять под контролем мониторинга продукции цитокинов и результатов генотипирования различные методы патогенетической терапии, прежде всего иммуностимуляторов/иммунодепрессантов, что позволит повысить эффективность и сроки лечения.

Выводы

1. В ходе проведенной специфической химиотерапии у больных туберкулезом легких в фазе продолжения с генотипом IL4-589CC отмечалось менее благоприятное течение заболевания в интенсивной фазе химиотерапии по сравнению с больными туберкулезом легких, имеющих генотип IL4-589CT+TT.
2. У пациентов с генотипом IL10-592CА+АА отмечается менее благоприятное течение заболевания в интенсивной фазе химиотерапии, чем у пациентов с генотипом IL10-592CC.
3. Взаимодействие микро- и макроорганизма при туберкулезной инфекции является достаточно сложным механизмом, в который вовлекаются многие звенья иммунной системы, а взаимодействие участников этой системы регулируется медиаторами клеточной системы – цитокинами.
4. Целесообразно внедрить генотипирование цитокинов в практику врача-фтизиатра с целью обеспечения индивидуализированного подхода к профилактике и лечению больных туберкулезом легких, что и станет предметом наших дальнейших исследований.

Об авторах

М. А. Алыменко

Университет «Синергия»; Казанская государственная медицинская академия» – филиал Российской медицинской академии непрерывного последипломного образования

Автор, ответственный за переписку.
Email: maxim.alymenko@gmail.com

к.м.н., доцент кафедры общей биологии и фармации; ассистент кафедры фтизиатрии и пульмонологии

Россия, Москва; Казань

Р. Ш. Валиев

Казанская государственная медицинская академия – филиал Российской медицинской академии непрерывного последипломного образования

Email: maxim.alymenko@gmail.com

д.м.н., профессор, главный фтизиатр Приволжского федерального округа, заслуженный врач России и Республики Татарстан, заведующий кафедрой фтизиатрии и пульмонологии

Россия, Казань

Н. Р. Валиев

Казанская государственная медицинская академия – филиал Российской медицинской академии непрерывного последипломного образования

Email: maxim.alymenko@gmail.com

к.м.н., доцент кафедры фтизиатрии и пульмонологии

Россия, Казань

Н. П. Бапобанова

Университет «Синергия»

Email: maxim.alymenko@gmail.com

к.б.н., доцент, заведующая кафедрой общей фармакологии и фармации

Россия, Москва

Н. Э. Колчанова

Гомельский государственный медицинский университет

Email: maxim.alymenko@gmail.com

к.м.н., доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии

Белоруссия, Гомель

Р. В. Полибин

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова

Email: maxim.alymenko@gmail.com

к.м.н., доцент, главный внештатный специалист-эпидемиолог Министерства здравоохранения РФ, заместитель директора по научной работе Института общественного здоровья имени Ф.Ф. Эрисмана, доцент кафедры эпидемиологии и доказательной медицины

Россия, Москва

Р. Н. Шепель

Национальный медицинский исследовательский центр терапии и профилактической медицины

Email: maxim.alymenko@gmail.com

к.м.н., доцент, главный внештатный специалист-терапевт ЦФО Министерства здравоохранения РФ, ведущий научный сотрудник, заместитель директора по перспективному развитию медицинской деятельности, руководитель отдела научно-стратегического развития первичной медико-санитарной помощи, доцент кафедры общественного здравоохранения и организации здравоохранения

Россия, Москва

В. А. Липатов

Курский государственный медицинский университет

Email: maxim.alymenko@gmail.com

проректор по научной работе и инновационному развитию, профессор кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии, заведующая лабораторией экспериментальной хирургии и онкологии НИИ экспериментальной медицины

Россия, Курск

В. М. Коломиец

Курский государственный медицинский университет

Email: maxim.alymenko@gmail.com

профессор кафедры клинической иммунологии, аллергологии и фтизиопульмонологии

Россия, Курск

Список литературы

Дополнительные файлы