Polymorphisms of cytokine genes and their correlations with efficiency of continuous treatment in patients with pulmonary tuberculosis

Full Text

Введение

На данный момент исследования в области иммуногенетики туберкулеза, как и других болезней [1], считаются одними из ключевых направлений из-за того, что эффективность лечения и исход болезни в большинстве случаев зависят от иммунологических и генетических особенностей организма. Особое внимание следует уделить значению IL-10 в развитии защитного иммунитета против туберкулеза [2, 3].

Необходимо подчеркнуть существенную функцию IL-10 в развитии иммунитета против туберкулеза. Известно, что этот цитокин сдерживает активацию макрофагов [4, 7]. В период туберкулезной инфекции IL-10 продуцируется макрофагами легких и дендритными клетками [5, 6].

В настоящее время существуют противоречивые данные о влиянии IL-10 на формирование иммунитета у пациентов с туберкулезом легких, что отражено в нескольких исследованиях. Например, Л.Г. Тарасова и коллеги связывают повышенную концентрацию IL-10 с обширными деструктивными процессами в легочной ткани [5], в то время как D. Higgins и соавт. демонстрируют его ключевую роль в защите от хронического воспаления легких [9].

Таким образом, изучение взаимосвязи между полиморфизмами генов цитокинов и их продукцией, а также оценка влияния этих факторов на эффективность противотуберкулезной терапии представляются перспективными. Блокирование цитокинов может стать потенциальной стратегией в разработке адъювантной иммунотерапии, особенно для случаев, связанных с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя – микобактерии туберкулеза (МБТ).

В рамках данного исследования была поставлена задача изучить связь между полиморфизмами генов цитокинов (IL1β, IL4, IL10, TNF), уровнем их экспрессии и эффективностью лечения антибактериальной терапии (химиотерапии) в фазе продолжения.

Материалы и методы

Группа исследования представлена 100 больными, страдающими туберкулезом легких (впервые выявленный туберкулез легких – 60 человек, туберкулез легких с хроническим течением – 40 человек) в возрасте от 18 до 65 лет, получивших химиотерапию в интенсивной и фазе продолжении (т. е. закончивших основной курс лечения в рекомендованные сроки согласно Приказа Минздрава РФ от 29 декабря 2014 г. № 951 «Об утверждении методических рекомендаций по совершенствованию диагностики и лечения туберкулеза органов дыхания»). Критериями исключения из исследования явились – пациенты с тяжелыми сопутствующими заболеваниями (злокачественные новообразования, системные заболевания кровеносной системы, сердечно-легочная и почечная недостаточность в стадии декомпенсации, резкое истощение, анемия, тиреотоксикоз, психические заболевания).

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации, использовали общепринятые во фтизиатрии методы и алгоритмы исследования в соответствии с приказом Минздрава РФ от 29 декабря 2014 г. № 951 «Об утверждении методических рекомендаций по совершенствованию диагностики и лечения туберкулеза органов дыхания».

В исследовании преобладали лица мужского пола, 82 человека – 76,7%. Средний возраст пациентов, включенных в исследование, составляет 46,3 года.

В группе исследования преобладали больные с инфильтративным (ИТЛ) и диссеминированным (ДТЛ) туберкулезом легких – в 37,0% и 31,0% соответственно. Фиброзно-кавернозную форму (ФКТЛ) диагностировали в 18,0%, а очаговую форму туберкулеза легких (ОТЛ) определяли в 14,0% случаев. В группе наблюдения рассматривали отдельно подгруппы больных, в зависимости от наличия у них определяемых лучевыми методами деструктивных изменений (фазы распада), с тяжелым и легким течением. Критерия эффективности лечения больных туберкулезом легких явились: исчезновение клинических и лабораторных признаков туберкулезного воспаления, стойкое прекращение бактериовыделения, подтвержденное микроскопическими и культуральными исследованиями, регрессия рентгенологических проявлений туберкулеза (очаговых, инфильтративных, деструктивных), а также восстановление функциональных возможностей организма больных и их трудоспособности.

Контрольная группа формировалась в ходе профилактических осмотров на предприятиях и государственных учреждениях, а также в стационарах ЛПУ г. Курска, не имеющих хронической патологии других органов и систем. Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике КГМА-филиала ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России (выписка из Протокола № 04/05 заседания Комитета по этике от 27.05.2021 года). Все пациенты подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании.

У всех обследуемых пациентов, включенных в исследование, проводился забор венозной крови для проведения молекулярно-генетических методов исследования. Геномную ДНК выделяли стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Генотипирование полиморфизмов (rs l6944) гена IL1, (rs2243250) гена IL4 (rsl800795) гена IL6 (rs l800896) гена IL-10 проводилось методом ПЦР в режиме реального времени путем дискриминации аллелей с помощью Taq Man-зондов на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США) с использованием протоколов, опубликованных в литературе [8]. Постановка полимеразной цепной реакции в режиме реального времени производилась с использованием наборов реагентов для генотипирования SNPs: -31T>C (rs1143627) IL1β, -589C/T (rs2243250) IL4, -592C/A (rs1800872) и -1082A/G (rs1800896) IL10 и -308G>A (rs1800629) TNF. Для проверки качества генотипирования 10% проб было выбрано случайным образом с целью повторного генотипирования, полученные результаты не отличались от первоначальных.

Для определения концентрации цитокинов (IL-1β, IL-4, IL-6, TNF, IFNγ, IL-10) в сыворотке крови использовалась взятая натощак из локтевой вены кровь, в стерильных условиях в количестве 5 мл. Образцы крови центрифугировались со скоростью 3500-4000 об/мин в течение 10 минут, затем сыворотку аликвотировали и замораживали при температуре ниже – 20 °С и хранили от 1 до 4 месяцев без повторных циклов размораживания и оттаивания. Непосредственно перед анализом все исследуемые сыворотки и компоненты тест-системы прогревались при комнатной температуре. Иммуноферментный анализ выполнялся с помощью наборов реактивов (АО «Вектор-Бест», Россия) строго по протоколу исследования, предложенному фирмой-производителем.

Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием программных пакетов SPSS Statistica 26, которая включала в себя проверку данных на нормальность распределения (критерий Колмогорова–Смирнова), непараметрический критерий корреляции Спирмена, критерий Уилкоксона (Вилкоксона) для связанных выборок, для сравнения качественных признаков использовался критерий хи-квадрат Пирсона.

Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди–Вайнберга использовали критерий ÷² Пирсона.

Результаты и обсуждение

В ходе проведения фазы продолжения отмечалось снижение уровня IL-4 у больных туберкулезом легких с генотипом IL4-589CC на 15,9% (базовый уровень IL-4 – 16,5 пг/мл, Сl_25-75 – 11,9-20,1, р < 0,0001; уровень IL-4 после проведения химиотерапии – 14,01 пг/ мл; Сl_25-75 – 11,1-17,5, р < 0,0001), а с генотипом IL4-589CT+TT – на 16,1% (базовый уровень IL-4 – 13,48 пг/мл, Сl_25-75 – 9,9-16,3, р < 0,0001; уровень IL-4 после проведения химиотерапии – 11,3 пг/мл; Сl_25-75 – 8,7-12,8, р < 0,0001) (табл. 1).

 

Таблица 1. Динамика уровня цитокинов в зависимости от полиморфизма генов цитокинов в процессе проведения фазы продолжения у больных туберкулезом легких

Table 1. Dynamics of level of cytokines depending on polymorphism of genes of cytokines in the course of carrying out a phase of continuation at suffering from tuberculosis lungs

Генотипы Genotypes	N	Базовый уровень цитокинов, медиана (пг/мл) Basic level of cytokines, median (pg/mL)	Интерквартильный размах до проведения интенсивной фазы химиотерапии (пг/мл) Interquartile scope before carrying out an intensive phase of chemotherapy (pg/mL)	Уровень цитокинов после завершения интенсивной фазы химиотерапии, медиана (пг/мл) Level of cytokines after end of an intensive phase of chemotherapy, a median (pg/mL)	Интерквартильный размах (пг/мл) после проведения интенсивной фазы химиотерапии (пг/мл) Interquartile scope (pg/mL) after carrying out an intensive phase of chemotherapy (pg/mL)	Изменение уровня цитокинов относительно базального уровня (%) Change of level of cytokines of rather basal level (%)	Контрольная группа (пг/мл) Control group (pg/mL)	р
IL4
IL4-589CC	29	16,5	11,9-20,1	14,01	11,1-17,5	-15,9	0,35	< 0,0001
IL4-589CT+TT	59	13,48	9,9-16,3	11,3	8,7-12,8	-16,1	0,3	< 0,0001
IL – TNF
TNF-308GG	76	6,6	3,8-8,4	5,6	3,4-6,8	-15,1	7,33	0,0001
TNF-308GA	12	6,5	3,5-8,4	5,7	4,2-6,8	-12,3	7,3	0,308
IL-10
IL10-592CC	83	35,6	31,6-41,2	29,9	24,6-35,0	-15,9	5,3	< 0,0001
IL10-592CA+AA	5	37,8	31,4-42,5	34,5	30,7-39,2	-8,5	5,5	< 0,345
IL – IFNγ
IL10-1082AA	4	6,6	6,07-7,20	6,65	5,24-7,96	+0,75	5,7	1,0
IL10-1082AG+GG	84	5,4	5,25-6,80	5,95	4,92-7,60	+10,1	5,2	< 0,0001

 

У больных туберкулезом легких с генотипом TNF-308GG отмечалось снижение уровня TNF на 15,1% (базовый уровень TNFα – 6,6 пг/мл, Сl_25-75 – 3,8-8,4, р = 0,0001; уровень TNFα после проведения специфической химиотерапии – 5,6 пг/ мл; Сl_25-75 – 3,4-6,8, р < 0,0001), в то время как у больных туберкулезом легких с генотипом TNF-308GA отмечалось снижение уровня TNF на 12,3% (базовый уровень TNFα – 6,5 пг/мл Сl_25-75 – 3,5-8,4, р = 0,308; уровень TNF после проведения специфической химиотерапии – 5,7 пг/ мл; Сl_25-75 – 4,2-6,8, р = 0,308) (табл. 1).

У больных туберкулезом легких с генотипом IL10-592CC отмечалось снижение уровня IL-10 на 15,9% (базовый уровень IL-10 – 35,6 пг/ мл, Сl_25-75 – 31,6-41,2, р < 0,0001; уровень IL-10 после проведения специфической химиотерапии – 29,9 пг/ мл; Сl_25-75 – 24,6-35,0, р < 0,0001), в то время как у больных туберкулезом легких с генотипом IL10-592CA+AA также отмечалось снижение уровня IL-10 на 8,5% (базовый уровень IL- 10 – 37,8 пг/мл, Сl_25-75 – 31,4-42,5, р < 0,0001; уровень IL-10 после проведения специфической химиотерапии – 34,5 пг/мл; Сl_25-75 – 30,7-39,2, р = 0,345) (табл. 1).

У больных туберкулезом легких с генотипом IL10 -1082АА отмечалось снижение уровня IL- 10 на 6,6% (базовый уровень IFNγ – 6,6 пг/ мл, Сl_{25- 75} – 6,07-7,2, р = 1,0; уровень IFNγ после проведения специфической химиотерапии – 6,65 пг/ мл; Сl_25-75 – 5,24-7,96, р = 1,0), в то время как, у больных туберкулезом легких с генотипом IL10 -1082АG+GG также отмечалось увеличение уровня IFNγ на 10,1% (базовый уровень IFNγ – 5,4 пг/мл, Сl_25-75 – 5,25-6,8, р < 0,0001; уровень IFNγ после проведения специфической химиотерапии – 5,95 пг/мл; Сl_25-75 – 4,92-7,6, р < 0,0001) (табл. 1).

В настоящем исследовании была также проанализирована эффективность лечения в фазе продолжения в зависимости от полиморфизма генов IL4-589 и IL10-592 (рис. 1).

 

Рисунок 1. Эффективность фазы продолжения в зависимости от генотипов цитокинов

Figure 1. Effectiveness of the continuation phase depending on the genotypes of cytokines

 

Показано, что эффективность лечения в этой фазе химиотерапии в 34,0% (р = 0,01) случаев связана с генотипом IL4-589CC, в 57,0% случаев (р = 0,01) – с генотипом IL4-589CT+TT, в 84,0% (р = 0,57) случаев – с генотипом IL10-592CC, в 7,0% (р = 0,57) случаев – с генотипом IL10-592CТ+ТТ, в то время как неэффективная фаза химиотерапии связана в 5,0% (р = 0,01) случаев с генотипом IL4-589CC, в 3,0% (р = 0,01) случаев – с генотипом IL4-589CT+TT, в 10,0% (р = 0,57) с генотипом IL10-592CC, в 0% случаев с генотипом IL10-592CА+АА (р = 0,57) (рис. 1).

При проведении химиотерапии наблюдаемых больных туберкулезом легких, обладающих генотипом IL4-589CC, было зафиксировано более неблагоприятное развитие болезни на этапе продолжения лечения по сравнению с теми, кто имеет генотип IL4-589CT+TT. У лиц с генотипом IL10-592CA+AA также наблюдалось менее благоприятное течение болезни в интенсивной фазе терапии по сравнению с пациентами, у которых генотип IL10-592CC.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что эффективность лечения больного с различными вариантами течения заболевания туберкулезом (тяжелое с деструктивными изменениями и легкое без таких изменений) была разной и связана с генотипами IL4 и IL10, при которых продукция цитокинов, предопределяющих в определенной степени эффективность лечения, была различной. Отсюда очевидно, что процесс взаимодействия между микроорганизмами (возбудители туберкулеза) и макроорганизмами (больной туберкулезом) в случае туберкулезной инфекции представляет собой довольно сложный процесс, задействующий множество элементов иммунной системы. Взаимодействие компонентов этой системы управляется посредством цитокинов – медиаторов клеточного взаимодействия.

С учетом результатов исследования, в перспективе с практической точки зрения данные генетического тестирования полиморфизмов генов возможно целесообразным рекомендовать при лечении больных туберкулезом применять под контролем мониторинга продукции цитокинов и результатов генотипирования различные методы патогенетической терапии, прежде всего иммуностимуляторов/иммунодепрессантов, что позволит повысить эффективность и сроки лечения.

Выводы

1. В ходе проведенной специфической химиотерапии у больных туберкулезом легких в фазе продолжения с генотипом IL4-589CC отмечалось менее благоприятное течение заболевания в интенсивной фазе химиотерапии по сравнению с больными туберкулезом легких, имеющих генотип IL4-589CT+TT.
2. У пациентов с генотипом IL10-592CА+АА отмечается менее благоприятное течение заболевания в интенсивной фазе химиотерапии, чем у пациентов с генотипом IL10-592CC.
3. Взаимодействие микро- и макроорганизма при туберкулезной инфекции является достаточно сложным механизмом, в который вовлекаются многие звенья иммунной системы, а взаимодействие участников этой системы регулируется медиаторами клеточной системы – цитокинами.
4. Целесообразно внедрить генотипирование цитокинов в практику врача-фтизиатра с целью обеспечения индивидуализированного подхода к профилактике и лечению больных туберкулезом легких, что и станет предметом наших дальнейших исследований.

About the authors

M. A. Alymenko

Synergy University; Kazan State Medical Academy, a Branch of the Russian Medical Academy of Continuous Postdegree Education

Author for correspondence.
Email: maxim.alymenko@gmail.com

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of General Biology and Pharmacy; Assistant Professor, Department of Phthisiology and Pulmonology

Russian Federation, Moscow; Kazan

R. Sh. Valiev

Kazan State Medical Academy, a Branch of the Russian Medical Academy of Continuous Postdegree Education

Email: maxim.alymenko@gmail.com

PhD, MD (Medicine), Professor, Chief Phthisiatrician of the Volga Federal District, Honored Doctor of Russia and the Republic of Tatarstan, Head, Department of Phthisiology and Pulmonology

Russian Federation, Kazan

N. R. Valiev

Kazan State Medical Academy, a Branch of the Russian Medical Academy of Continuous Postdegree Education

Email: maxim.alymenko@gmail.com

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Phthisiology and Pulmonology

Russian Federation, Kazan

N. P. Balabanova

Synergy University

Email: maxim.alymenko@gmail.com

PhD (Biology), Associate Professor, Head, Department of General Pharmacology and Pharmacy

Russian Federation, Moscow

N. E. Kolchanova

Gomel State Medical University

Email: maxim.alymenko@gmail.com

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology

Belarus, Gomel

R. V. Polybin

I. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: maxim.alymenko@gmail.com

PhD (Medicine), Associate Professor, Chief Non-Staff Specialist Epidemiologist of the Russian Ministry of Health, Deputy Director for Scientific Work of F. Erisman Institute of Public Health, Associate Professor, Department of Epidemiology and Evidential Medicine

Russian Federation, Moscow

R. N. Shepel

National Medical Research Center of Therapy and Preventive Medicine

Email: maxim.alymenko@gmail.com

PhD (Medicine), Associate Professor, Chief Non-Staff Specialist Therapist of the CFD of the Russian Ministry of Health, Leading Research Associate, Deputy Director for Perspective Development of Medical Activity, Head, Department of Scientific and Strategic Development of Primary Health Care, Associate Professor, Department of Public Health Care and Organization of Health Care

Russian Federation, Moscow

V. A. Lipatov

Kursk State Medical University

Email: maxim.alymenko@gmail.com

Vice-Rector for Scientific Work and Innovative Development, Professor of the Department of Operative Surgery and Topographic Anatomy, Head of the Laboratory of Experimental Surgery and Oncology, Research Institute of Experimental Medicine

Russian Federation, Kursk

V. M. Kolomiets

Kursk State Medical University

Email: maxim.alymenko@gmail.com

Professor, Department of Clinical Immunology, Allergology and Phthisiopulmonology

Russian Federation, Kursk

References

Supplementary files