Амбивалентность влияния иммунорегуляторных пептидов на антигенпрезентирующую субпопуляцию нейтрофильных гранулоцитов при гнойно-воспалительных заболеваниях in vitro

Полный текст

Введение

Нейтрофильные гранулоциты (НГ) больше не считаются популяцией окончательно дифференцированных, короткоживущих клеток. НГ представлены субпопуляциями с различными функциями, которые определяются в норме и при различных заболеваниях [5]. НГ рассматриваются как потенциальные регуляторы иммунного ответа (ИО) [8]. Функциональная пластичность позволяет НГ устанавливать сложные взаимосвязи с различными клетками иммунной системы (тромбоцитами, дендритными клетками, субпопуляциями лимфоцитов), влиять на их активность медиаторами как предварительно синтезированными, так и вновь синтезированными и, зачастую, определять течение и исход воспалительного процесса в целом [12].

Очевидно, что НГ участвуют в реакциях адаптивного иммунитета, взаимодействуя с Т-клетками. Одним из механизмов является способность НГ экспрессировать молекулы HLA-DR [11]. Было показано, что НГ имеют в секреторных везикулах внутриклеточные запасы молекул HLA-DR и ко-рецепторов CD80 и CD86, которые при взаимодействии с LPS, fMLP, форбол-миристат-ацетатом (FMA) транслоцируются в течение 2-5 мин на поверхность клеток вследствие Ca²⁺-зависимой перекрестной сшивки Mac-1 (CD11b/CD18) [1]. Экспрессия молекул HLA-DR и ко-рецепторов CD80, CD86 и CD83 у НГ здоровых лиц может быть также вызвана влиянием GM-CSF, IL-3 и IFNγ или их комбинацией, аутологичными Т-клетками, при этом типичные маркеры НГ (CD66b, CD15 и интегрин, включая CD11a/b/c) и функции сохраняются [8]. НГ-АПК присутствуют в ПК у пациентов с раком [15], инфекциями [4, 11] аллергическими и аутоиммунными заболеваниями [14].^. Показано, что НГ, экспрессирующие молекулы HLA-DR, могут представлять антигены T-клеткам CD4⁺, которые в ответ на презентацию вырабатывают иммунорегуляторные цитокины, инициирующие ИО, что может приводить к замедлению развития заболевания или его усугублению [7]. В частности, было обнаружено, что у людей с ревматоидным артритом в синовиальной жидкости выявляются НГ с фенотипом АПК, которые при взаимодействии с T-клетками вызывают их пролиферацию [14]. Cубпопуляция НГ-АПК обнаружены в ПК пациентов с гиперлипидемией и в атеросклеротических бляшках мышей LDLr-/-. Клинические данные показывают положительную корреляцию между НГ-АПК и CD3⁺T-клетками, что подразумевает, что НГ-АПК могут способствовать прогрессированию атеросклероза посредством активации адаптивной иммунной системы [13]. C другой стороны, имеются данные о том, что долгоживущие НГ-АПК стимулируют и усиливают реакции противоопухолевых эффекторных Т-клеток.

Работа Mysore V. и соавт. показывает, что связывание иммунных комплексов или человеческого конъюгата антитела IgG – FcγRIIIB с антигеном, приводит к дифференцировке зрелых НГ в гибридные АПК клетки с фенотипом CD14⁺HLA-DR⁺CD11b⁺CD66b⁺CD15^hi в процессе, требующем эндоцитоза FcγR. Данные НГ- АПК секретируют цитокины, иммуногенные, как классические ДК, и мигрируют в лимфатические узлы, где они взаимодействуют с Т-клетками. Установлено, что для генерации НГ-АПК необходим фактор транскрипции PU.1. Сгенерированные НГ-АПК активируют Т-клетки с противоопухолевыми свойствами, могут быть получены путем введения анти-FcγRIII, конъюгированного с определенным антигеном, а клональные НГ, несущие неоантигены от пациентов с миелоидными новообразованиями, могут быть преобразованы в иммуногенные НГ-АПК, которые активируют Т-клетки антиген-независимым образом. Эти подходы могут быть использованы в качестве иммунотерапевтических стратегий на основе Т-клеток для лечения рака [12]. Также приведены доказательства того, что сгенерированные НГ- АПК эффективно обрабатывают вакцинные бактериальные токсины и активируют Т-клетки, что предполагает потенциальный способ борьбы с инфекциями. И наоборот, повышение НГ- АПК в крови пациентов с СКВ коррелирует с тяжестью заболевания, что предполагает, что они могут быть патогенными при аутоиммунных расстройствах [12].

Ранее в наших исследованиях при остром гематогенном остеомиелите (ОГО) выявлена и описана субпопуляция НГ-АПК с фенотипом CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ [2].

ОГО – гнойно-воспалительный процесс, особенность которого – место локализации (кости, костный мозг, окружающие их мягкие ткани) содержащее все цитокины, необходимые для дифференцировки и созревания миелоидных клеток и лимфоцитов, под действием которых может изменяться ИО [2]. Ведущая роль в патогенезе ОГО принадлежит дисфункциям НГ. Появление на поверхностной мембране НГ при ОГО молекул HLA-DR свидетельствует о праймировании НГ, что предполагает возможность влиять на фенотип НГ, в том числе экспрессию HLA-DR, иными инициирующими факторами и представляет интерес для возможной коррекции их функций.

В этом плане изучение эффектов пептидов с доказанными иммунорегуляторными функциями и разными механизмами действия: синтетического гексапептида (Аргинил-á-Аспартил-Лизил-Валил-Тирозил-Аргинин) – (ГП), способного связываться с молекулами HLA- DR [10], и глюкозаминилмурамилдипептида (N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглютамин) – ГМДП, агониста NOD2-рецепторов на фенотип субпопуляций НГ, экспрессирующих рецепторы CD16, CD66b, CD33 и HLA-DR, является перспективным.

Цель исследования – оценить эффекты воздействия гексапептида и глюкозаминилмурамилдипептида в эксперименте in vitro на субпопуляции CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ нейтрофильных гранулоцитов при остром гематогенном остеомиелите у детей.

Материалы и методы

Проведено изучение образцов ПК 28 детей с ОГО 8-15 лет (4 девочки, 24 мальчика) – группа исследования (ГИ); 13 условно здоровых детей 8-15 лет – группа сравнения (ГС).

Группа исследования 1 (ГИ1) – образцы ПК детей с ОГО культивировали с ГП (10^-6 г/л) в течение 60 мин, 37 °С.

Группа исследования 2 (ГИ2) – образцы ПК детей с ОГО культивировали с ГМДП (10^-6 г/л) в течение 60 мин, 37 °С.

Для оценки клеточных маркеров использовался цитометр FC 500 Beckman Coulter (США). Оценивали процент субпопуляций одновременно экспрессирующих CD16, CD66b, CD33 и экспрессирующих или не имеющих HLA-DR рецепторы (CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺НГ, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-НГ); по интенсивности флюоресценции (MFI) определяли плотность экспрессии молекул до и после инкубации с имунотропными пептидами.

CD66b (GPI – гликопротеин) – паннейтрофильный маркер, имеет низкую плотность экспрессии, которая значительно повышается при активации клетки [9].

CD16 (FcγIII) рецептор НГ (палочкоядерных и сегментоядерных форм). Повышенная экспрессия CD16 является признаком активации НГ. При тяжело протекающем инфекционном процессе зачастую из костного мозга в кровоток поступают незрелые формы НГ, о чем говорит отсутствие или низкая экспрессия на их мембране CD16 [3].

CD33 (Siglec-3) представляет собой заякоренный в мембране клеток рецептор, который имеют незрелые клетки миелоидного ростка, а также зрелые НГ. Имеет в своем составе участки, богатые тирозином (ITIM), которые выполняют регулирующую роль в ингибировании клеточной активности [6].

HLA-DR – гликопротеин, который отсутствует на мембране циркулирующих НГ. Экспрессия HLA-DR на НГ повышается при активации последних, а также обнаруживается у тканевых форм НГ при воспалении [14].

Проводилась оценка фагоцитарной функции Н по способности НГ элиминировать S. aureus (штамм 209). Производился подсчет НГ, поглотивших бактерии – %ФАГ, фагоцитарное число (ФЧ) и фагоцитарный индекс (ФИ); оценивалась киллинговая способность НГ – процент (%П) и индекс (ИП) переваривания.

Статистическая обработка осуществлялась в Microsoft Excel 2016 и StatPlus 2020. Результаты представлены в виде медианы и квартильного диапазона – Me (Q_0,25-Q_0,75); Статистические различия анализировались с использованием критерия Манна–Уитни. Значимыми считали различия значений при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Установлено, что в образцах ПК ГС НГ были представлены в 98,8 (98,0-100) % субпопуляцией с фенотипом CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-НГ. По показателю MFI плотность экспрессии молекул составила для CD66b – 4,6 (4,2-5,0), CD33 – 3,7 (3,3-4,6), CD16 – 81,5 (69,2-99,1).

В ГИ были выявлены две субпопуляции НГ: 71,2 (52,5-80,5) % с фенотипом СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- и 30,3 (16,5-34,8) % с фенотипом СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺, с плотностью экспрессии MFI HLA-DR – 2,2 (1,8-4,0). По отношению к ГС в ГИ выявлено снижение в 1,4 раза численности НГ субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- (р < 0,05). Обе субпопуляции отличались от ГС (р_{1, 2} < 0,05) более высокой плотностью экспрессии молекул CD16 и CD66b. Наблюдалась более высокая плотность экспрессии CD33 – 3,5 (3,3-4,2) (р < 0,05) в субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺НГ, уровень которого не отличался (р > 0,05) от ГС в субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-НГ (рис. 1).

 

Рисунок 1. Соотношение (А) и фенотипические характеристики (Б) субпопуляций СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- и СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ нейтрофильных гранулоцитов при остром гематогенном остеомиелите

Примечание. * – отличия показателей ГС и ГИ, p < 0,05.

Figure 1. Correlation (A) and phenotypic characteristics (B) of subsets CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- and CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ neutrophil granulocytes in acute hematogenous osteomyelitis

Note. *, differences in indicators between the comparison group (CG) and the study group (SG), p < 0.05.

 

Выявленные изменения подтверждают данные литературы о том, что включение НГ в иммунный ответ сопровождается изменением их поверхностного репертуара рецепторов. Об этом свидетельствует мобилизация CD16 и CD66b из внутриклеточных депо клетки, что сопровождается потенцированием фагоцитарной и микробицидной активности НГ. Транслокация CD66b из внутриклеточных компартментов потенцирует протеинкиназу и выроботку IL-8, что сопровождается привлечением в очаг воспаления НГ из циркуляторного русла [3]. Одновременно CD66b играет роль рецептора к галектину-3 на CD4⁺ наивных T-клетках и Т-клетках памяти [9]. Взаимовлияние НГ и CD4⁺ T-клеток через контакт CD66b-галектин-3 приводит к экспрессии на НГ HLA-DR. Помимо этого, контакт НГ с CD4⁺T-клетками через связывание HLA-DR и TCR стимулирует секрецию лимфоцитами цитокинов, которые вызывают дополнительную экспрессию HLA-DR на НГ [9].

Под влиянием ГП в ГИ1 отмечено снижение доли субпопуляции НГ-АПК до 20,3 (18,7-39,0) % против 30,2 (16,4-34,9) % (р > 0,05) до инкубации с ГП и повышение СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- НГ - 80,7 (72,5-84,5) % (р > 0,05). Вероятно, перераспределение субпопуляций произошло из-за возможного связывания ГП с HLA-DR на мембране НГ. Кроме того, на НГ субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ выявлено снижение MFI HLA-DR до 1,7 (1,6-2,2), в 1,4 раза MFI CD16 (р < 0,05) в сравнении с показателями ГИ до инкубации (р > 0,05) и, напротив, усиление в 1,3 раза плотности экспрессии CD66b – 8,2 (8,0- 11,1) (р < 0,05). Под действием ГП MFI CD16 и CD66b рецепторов (р_{1, 2} > 0,05) не изменялась на субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-НГ. Также в обеих субпопуляциях наблюдалось отсутствие влияния ГП на MFI молекул CD33 (рис. 2).

 

Рисунок 2. Эффекты влияния гексапептида и глюкозаминилмурамилдипептида на соотношение (А) и фенотип (Б) субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов при остром гематогенном остеомиелите

Примечание. ^ – отличия показателей ГИ и ГИ 1, p < 0,05; # – отличия показателей ГИ и ГИ 2, p < 0,05; ▪ – отличия показателей ГИ 1 и ГИ 2, p < 0,05.

Figure 2. Effects of hexapeptide and glucosaminylmuramyl dipeptide on the ratio (A) and phenotype (B) of subsets of neutrophil granulocytes in acute hematogenous osteomyelitis

Note. ^, differences between SG and SG 1 indicators, p < 0.05; #, differences between SG and SG 2 indicators, p < 0.05; ▪, differences between SG 1 and SG 2, p < 0.05.

 

Несколько иные трансформации фенотипа выявлены под действием ГМДП.

Культивирование НГ ПК in vitro с ГМДП (ГИ2) не влияло на соотношение НГ исследуемых субпопуляций СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ и СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-.

В обеих субпопуляциях НГ под влиянием ГМДП было выявлено значимое повышение в 1,7 раз в сравнении с ГИ и в 1,5 раза в сравнении с ГИ1 после инкубации с ГП MFI CD66b (р_{1, 2} < 0,05), в 1,4 раза в сравнении с ГИ и ГИ1 MFI CD33 (р_{1, 2} < 0,05), тенденция снижения MFI CD16 (р_{1, 2} > 0,05). Также под влиянием ГМДП в субпопуляций НГ-АПК – СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺НГ определена выраженная по значениям медианы тенденция усиления плотности экспрессии HLA-DR (р > 0,05) как в сравнении с показателями в ГИ, так и была в 1,5 раза выше, чем после влияния ГП (рис. 2).

При исследовании влияния ГП и ГМДП на фагоцитарную функцию НГ у детей с ОГО в системе in vitro были выявлены однонаправленные позитивные эффекты восстановления показателей %ФАГ и %П до значений ГС. Под влиянием ГП показан рост %ФАГ до 75,9 (70,1-77,0) % против 51,1 (42,7-58,0) % в ГИ и 54,8 (51,5-57,7) % в ГС (р_{1, 2} < 0,05); повышение киллинговой эффективности – %П с 41,8 (37,5-44,4) % в ГИ до 57,4 (53,4-61,4) % до показателей ГС – 64,6 (61,0-66,9) (р_{1, 2} < 0,05) (рис. 3).

 

Рисунок 3. Изменение фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов до и после культивирования in vitro с иммунорегуляторными пептидами при остром гематогенном остеомиелите у детей

Примечание. * – отличия показателей ГС и ГИ, p < 0,05; ^ – отличия показателей ГИ и ГИ 1, p < 0,05; # – отличия показателей ГИ и ГИ 2, p < 0,05; ▪ – отличия показателей ГИ 1 и ГИ 2, p < 0,05.

Figure 3. Changes in the phagocytic activity of neutrophil granulocytes before and after cultivation in vitro with immunoregulatory peptides in acute hematogenous osteomyelitis in children

Note. *, differences in indicators between the comparison group (CG) and the study group (SG), p < 0.05; ^, differences between SG and SG 1 indicators, p < 0.05; #, differences between SG and SG 2 indicators, p < 0.05; ▪, differences between SG 1 and SG 2, p < 0.05.

 

Под действием ГМДП также наблюдалось повышение %ФАГ 63,0 (52,0-65,0) % и %П 63,0 (59,3-66,9) до показателей ГС (р < 0,05) (рис. 3).

Полученные результаты экспериментального исследования очередной раз показывают функциональную гибкость НГ и модулирующую роль ГП и ГМДП на популяции НГ СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- и СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺, что дает возможность использовать иммунорегуляторные пептиды для восстановления дисфункций НГ.

Под влиянием ГМДП отмечается значимое повышение МFI CD 66b и МFI CD33 рецепторов (р_{1, 2} < 0,05) в обеих субпопуляциях, отмечается тенденция повышения МFI HLA-DR (p > 0,05) на субпопуляции НГ-АПК. Роль CD33 на НГ малоизучена. Однако показано, что CD33 связываясь с ITAM, содержащими CD16 рецепторами, ингибирует цитотоксическую активность NK-лимфоцитов [6].

Эффекты влияния ГП в большей мере проявляются в отношении изменения фенотипа субпопуляции НГ – АПК. Отмечается повышение плотности экспрессии MFI CD66b (р < 0,05), снижение MFI CD16 (р < 0,05) и MFI HLA-DR (p > 0,05).

Модулирующие эффекты ГП и ГМДП на фенотип субпопуляций НГ СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ и СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- приводят к восстановлению фагоцитарной функции НГ. Под влиянием ГП и ГМДП увеличение MFI молекулы CD66b (р_{1, 2} < 0,05), что способствует улучшению хемотаксиса и адгезивных свойств НГ, необходимых для реализации эффекторных функций. Кроме того, ГП статистически значимо уменьшает MFI CD16, снижая гиперактивацию клеток, направленную на цитотоксическую активность, дегрануляцию и формирование NEТs.

Заключение

Факт детекции в ПК детей с ОГО субпопуляции «долгоживущих» активированных НГ с фенотипом СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺, со свойствами АПК, представляющих АГ T-лимфоцитам, оставляет перед исследователями нерешенный вопрос: будет ли такая трансформация способствовать или замедлять прогрессирование гнойно-воспалительного процесса. В любом случае, выявленные различные эффекты иммунотропных пептидов в системе in vitro демонстрируют возможность модулировать фенотип субпопуляции НГ-АПК, способствуя восстановлению эффекторных функции НГ.

Об авторах

И. В. Нестерова

Кубанский государственный медицинский университет; Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы

Email: chudilova2015@yandex.ru

д.м.н., профессор, главный научный сотрудник отдела клинико-экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории; профессор кафедры клинической иммунологии, аллергологии и адаптологии факультета непрерывного медицинского образования Медицинского института

Россия, Краснодар; Москва

Г. А. Чудилова

Кубанский государственный медицинский университет

Email: chudilova2015@yandex.ru

д.б.н., доцент, заведующая отделом клинико-экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории, профессор кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики

Россия, Краснодар

Ю. В. Тетерин

Кубанский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: chudilova2015@yandex.ru

аспирант кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики

Россия, Краснодар

Список литературы

Дополнительные файлы