Ambivalent in vitro effect of immunoregulatory peptides on antigen-presenting subsets of neutrophil granulocytes in purulent inflammatory diseases

Full Text

Введение

Нейтрофильные гранулоциты (НГ) больше не считаются популяцией окончательно дифференцированных, короткоживущих клеток. НГ представлены субпопуляциями с различными функциями, которые определяются в норме и при различных заболеваниях [5]. НГ рассматриваются как потенциальные регуляторы иммунного ответа (ИО) [8]. Функциональная пластичность позволяет НГ устанавливать сложные взаимосвязи с различными клетками иммунной системы (тромбоцитами, дендритными клетками, субпопуляциями лимфоцитов), влиять на их активность медиаторами как предварительно синтезированными, так и вновь синтезированными и, зачастую, определять течение и исход воспалительного процесса в целом [12].

Очевидно, что НГ участвуют в реакциях адаптивного иммунитета, взаимодействуя с Т-клетками. Одним из механизмов является способность НГ экспрессировать молекулы HLA-DR [11]. Было показано, что НГ имеют в секреторных везикулах внутриклеточные запасы молекул HLA-DR и ко-рецепторов CD80 и CD86, которые при взаимодействии с LPS, fMLP, форбол-миристат-ацетатом (FMA) транслоцируются в течение 2-5 мин на поверхность клеток вследствие Ca²⁺-зависимой перекрестной сшивки Mac-1 (CD11b/CD18) [1]. Экспрессия молекул HLA-DR и ко-рецепторов CD80, CD86 и CD83 у НГ здоровых лиц может быть также вызвана влиянием GM-CSF, IL-3 и IFNγ или их комбинацией, аутологичными Т-клетками, при этом типичные маркеры НГ (CD66b, CD15 и интегрин, включая CD11a/b/c) и функции сохраняются [8]. НГ-АПК присутствуют в ПК у пациентов с раком [15], инфекциями [4, 11] аллергическими и аутоиммунными заболеваниями [14].^. Показано, что НГ, экспрессирующие молекулы HLA-DR, могут представлять антигены T-клеткам CD4⁺, которые в ответ на презентацию вырабатывают иммунорегуляторные цитокины, инициирующие ИО, что может приводить к замедлению развития заболевания или его усугублению [7]. В частности, было обнаружено, что у людей с ревматоидным артритом в синовиальной жидкости выявляются НГ с фенотипом АПК, которые при взаимодействии с T-клетками вызывают их пролиферацию [14]. Cубпопуляция НГ-АПК обнаружены в ПК пациентов с гиперлипидемией и в атеросклеротических бляшках мышей LDLr-/-. Клинические данные показывают положительную корреляцию между НГ-АПК и CD3⁺T-клетками, что подразумевает, что НГ-АПК могут способствовать прогрессированию атеросклероза посредством активации адаптивной иммунной системы [13]. C другой стороны, имеются данные о том, что долгоживущие НГ-АПК стимулируют и усиливают реакции противоопухолевых эффекторных Т-клеток.

Работа Mysore V. и соавт. показывает, что связывание иммунных комплексов или человеческого конъюгата антитела IgG – FcγRIIIB с антигеном, приводит к дифференцировке зрелых НГ в гибридные АПК клетки с фенотипом CD14⁺HLA-DR⁺CD11b⁺CD66b⁺CD15^hi в процессе, требующем эндоцитоза FcγR. Данные НГ- АПК секретируют цитокины, иммуногенные, как классические ДК, и мигрируют в лимфатические узлы, где они взаимодействуют с Т-клетками. Установлено, что для генерации НГ-АПК необходим фактор транскрипции PU.1. Сгенерированные НГ-АПК активируют Т-клетки с противоопухолевыми свойствами, могут быть получены путем введения анти-FcγRIII, конъюгированного с определенным антигеном, а клональные НГ, несущие неоантигены от пациентов с миелоидными новообразованиями, могут быть преобразованы в иммуногенные НГ-АПК, которые активируют Т-клетки антиген-независимым образом. Эти подходы могут быть использованы в качестве иммунотерапевтических стратегий на основе Т-клеток для лечения рака [12]. Также приведены доказательства того, что сгенерированные НГ- АПК эффективно обрабатывают вакцинные бактериальные токсины и активируют Т-клетки, что предполагает потенциальный способ борьбы с инфекциями. И наоборот, повышение НГ- АПК в крови пациентов с СКВ коррелирует с тяжестью заболевания, что предполагает, что они могут быть патогенными при аутоиммунных расстройствах [12].

Ранее в наших исследованиях при остром гематогенном остеомиелите (ОГО) выявлена и описана субпопуляция НГ-АПК с фенотипом CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ [2].

ОГО – гнойно-воспалительный процесс, особенность которого – место локализации (кости, костный мозг, окружающие их мягкие ткани) содержащее все цитокины, необходимые для дифференцировки и созревания миелоидных клеток и лимфоцитов, под действием которых может изменяться ИО [2]. Ведущая роль в патогенезе ОГО принадлежит дисфункциям НГ. Появление на поверхностной мембране НГ при ОГО молекул HLA-DR свидетельствует о праймировании НГ, что предполагает возможность влиять на фенотип НГ, в том числе экспрессию HLA-DR, иными инициирующими факторами и представляет интерес для возможной коррекции их функций.

В этом плане изучение эффектов пептидов с доказанными иммунорегуляторными функциями и разными механизмами действия: синтетического гексапептида (Аргинил-á-Аспартил-Лизил-Валил-Тирозил-Аргинин) – (ГП), способного связываться с молекулами HLA- DR [10], и глюкозаминилмурамилдипептида (N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглютамин) – ГМДП, агониста NOD2-рецепторов на фенотип субпопуляций НГ, экспрессирующих рецепторы CD16, CD66b, CD33 и HLA-DR, является перспективным.

Цель исследования – оценить эффекты воздействия гексапептида и глюкозаминилмурамилдипептида в эксперименте in vitro на субпопуляции CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ нейтрофильных гранулоцитов при остром гематогенном остеомиелите у детей.

Материалы и методы

Проведено изучение образцов ПК 28 детей с ОГО 8-15 лет (4 девочки, 24 мальчика) – группа исследования (ГИ); 13 условно здоровых детей 8-15 лет – группа сравнения (ГС).

Группа исследования 1 (ГИ1) – образцы ПК детей с ОГО культивировали с ГП (10^-6 г/л) в течение 60 мин, 37 °С.

Группа исследования 2 (ГИ2) – образцы ПК детей с ОГО культивировали с ГМДП (10^-6 г/л) в течение 60 мин, 37 °С.

Для оценки клеточных маркеров использовался цитометр FC 500 Beckman Coulter (США). Оценивали процент субпопуляций одновременно экспрессирующих CD16, CD66b, CD33 и экспрессирующих или не имеющих HLA-DR рецепторы (CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺НГ, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-НГ); по интенсивности флюоресценции (MFI) определяли плотность экспрессии молекул до и после инкубации с имунотропными пептидами.

CD66b (GPI – гликопротеин) – паннейтрофильный маркер, имеет низкую плотность экспрессии, которая значительно повышается при активации клетки [9].

CD16 (FcγIII) рецептор НГ (палочкоядерных и сегментоядерных форм). Повышенная экспрессия CD16 является признаком активации НГ. При тяжело протекающем инфекционном процессе зачастую из костного мозга в кровоток поступают незрелые формы НГ, о чем говорит отсутствие или низкая экспрессия на их мембране CD16 [3].

CD33 (Siglec-3) представляет собой заякоренный в мембране клеток рецептор, который имеют незрелые клетки миелоидного ростка, а также зрелые НГ. Имеет в своем составе участки, богатые тирозином (ITIM), которые выполняют регулирующую роль в ингибировании клеточной активности [6].

HLA-DR – гликопротеин, который отсутствует на мембране циркулирующих НГ. Экспрессия HLA-DR на НГ повышается при активации последних, а также обнаруживается у тканевых форм НГ при воспалении [14].

Проводилась оценка фагоцитарной функции Н по способности НГ элиминировать S. aureus (штамм 209). Производился подсчет НГ, поглотивших бактерии – %ФАГ, фагоцитарное число (ФЧ) и фагоцитарный индекс (ФИ); оценивалась киллинговая способность НГ – процент (%П) и индекс (ИП) переваривания.

Статистическая обработка осуществлялась в Microsoft Excel 2016 и StatPlus 2020. Результаты представлены в виде медианы и квартильного диапазона – Me (Q_0,25-Q_0,75); Статистические различия анализировались с использованием критерия Манна–Уитни. Значимыми считали различия значений при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Установлено, что в образцах ПК ГС НГ были представлены в 98,8 (98,0-100) % субпопуляцией с фенотипом CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-НГ. По показателю MFI плотность экспрессии молекул составила для CD66b – 4,6 (4,2-5,0), CD33 – 3,7 (3,3-4,6), CD16 – 81,5 (69,2-99,1).

В ГИ были выявлены две субпопуляции НГ: 71,2 (52,5-80,5) % с фенотипом СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- и 30,3 (16,5-34,8) % с фенотипом СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺, с плотностью экспрессии MFI HLA-DR – 2,2 (1,8-4,0). По отношению к ГС в ГИ выявлено снижение в 1,4 раза численности НГ субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- (р < 0,05). Обе субпопуляции отличались от ГС (р_{1, 2} < 0,05) более высокой плотностью экспрессии молекул CD16 и CD66b. Наблюдалась более высокая плотность экспрессии CD33 – 3,5 (3,3-4,2) (р < 0,05) в субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺НГ, уровень которого не отличался (р > 0,05) от ГС в субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-НГ (рис. 1).

 

Рисунок 1. Соотношение (А) и фенотипические характеристики (Б) субпопуляций СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- и СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ нейтрофильных гранулоцитов при остром гематогенном остеомиелите

Примечание. * – отличия показателей ГС и ГИ, p < 0,05.

Figure 1. Correlation (A) and phenotypic characteristics (B) of subsets CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- and CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ neutrophil granulocytes in acute hematogenous osteomyelitis

Note. *, differences in indicators between the comparison group (CG) and the study group (SG), p < 0.05.

 

Выявленные изменения подтверждают данные литературы о том, что включение НГ в иммунный ответ сопровождается изменением их поверхностного репертуара рецепторов. Об этом свидетельствует мобилизация CD16 и CD66b из внутриклеточных депо клетки, что сопровождается потенцированием фагоцитарной и микробицидной активности НГ. Транслокация CD66b из внутриклеточных компартментов потенцирует протеинкиназу и выроботку IL-8, что сопровождается привлечением в очаг воспаления НГ из циркуляторного русла [3]. Одновременно CD66b играет роль рецептора к галектину-3 на CD4⁺ наивных T-клетках и Т-клетках памяти [9]. Взаимовлияние НГ и CD4⁺ T-клеток через контакт CD66b-галектин-3 приводит к экспрессии на НГ HLA-DR. Помимо этого, контакт НГ с CD4⁺T-клетками через связывание HLA-DR и TCR стимулирует секрецию лимфоцитами цитокинов, которые вызывают дополнительную экспрессию HLA-DR на НГ [9].

Под влиянием ГП в ГИ1 отмечено снижение доли субпопуляции НГ-АПК до 20,3 (18,7-39,0) % против 30,2 (16,4-34,9) % (р > 0,05) до инкубации с ГП и повышение СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- НГ - 80,7 (72,5-84,5) % (р > 0,05). Вероятно, перераспределение субпопуляций произошло из-за возможного связывания ГП с HLA-DR на мембране НГ. Кроме того, на НГ субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ выявлено снижение MFI HLA-DR до 1,7 (1,6-2,2), в 1,4 раза MFI CD16 (р < 0,05) в сравнении с показателями ГИ до инкубации (р > 0,05) и, напротив, усиление в 1,3 раза плотности экспрессии CD66b – 8,2 (8,0- 11,1) (р < 0,05). Под действием ГП MFI CD16 и CD66b рецепторов (р_{1, 2} > 0,05) не изменялась на субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-НГ. Также в обеих субпопуляциях наблюдалось отсутствие влияния ГП на MFI молекул CD33 (рис. 2).

 

Рисунок 2. Эффекты влияния гексапептида и глюкозаминилмурамилдипептида на соотношение (А) и фенотип (Б) субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов при остром гематогенном остеомиелите

Примечание. ^ – отличия показателей ГИ и ГИ 1, p < 0,05; # – отличия показателей ГИ и ГИ 2, p < 0,05; ▪ – отличия показателей ГИ 1 и ГИ 2, p < 0,05.

Figure 2. Effects of hexapeptide and glucosaminylmuramyl dipeptide on the ratio (A) and phenotype (B) of subsets of neutrophil granulocytes in acute hematogenous osteomyelitis

Note. ^, differences between SG and SG 1 indicators, p < 0.05; #, differences between SG and SG 2 indicators, p < 0.05; ▪, differences between SG 1 and SG 2, p < 0.05.

 

Несколько иные трансформации фенотипа выявлены под действием ГМДП.

Культивирование НГ ПК in vitro с ГМДП (ГИ2) не влияло на соотношение НГ исследуемых субпопуляций СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ и СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-.

В обеих субпопуляциях НГ под влиянием ГМДП было выявлено значимое повышение в 1,7 раз в сравнении с ГИ и в 1,5 раза в сравнении с ГИ1 после инкубации с ГП MFI CD66b (р_{1, 2} < 0,05), в 1,4 раза в сравнении с ГИ и ГИ1 MFI CD33 (р_{1, 2} < 0,05), тенденция снижения MFI CD16 (р_{1, 2} > 0,05). Также под влиянием ГМДП в субпопуляций НГ-АПК – СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺НГ определена выраженная по значениям медианы тенденция усиления плотности экспрессии HLA-DR (р > 0,05) как в сравнении с показателями в ГИ, так и была в 1,5 раза выше, чем после влияния ГП (рис. 2).

При исследовании влияния ГП и ГМДП на фагоцитарную функцию НГ у детей с ОГО в системе in vitro были выявлены однонаправленные позитивные эффекты восстановления показателей %ФАГ и %П до значений ГС. Под влиянием ГП показан рост %ФАГ до 75,9 (70,1-77,0) % против 51,1 (42,7-58,0) % в ГИ и 54,8 (51,5-57,7) % в ГС (р_{1, 2} < 0,05); повышение киллинговой эффективности – %П с 41,8 (37,5-44,4) % в ГИ до 57,4 (53,4-61,4) % до показателей ГС – 64,6 (61,0-66,9) (р_{1, 2} < 0,05) (рис. 3).

 

Рисунок 3. Изменение фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов до и после культивирования in vitro с иммунорегуляторными пептидами при остром гематогенном остеомиелите у детей

Примечание. * – отличия показателей ГС и ГИ, p < 0,05; ^ – отличия показателей ГИ и ГИ 1, p < 0,05; # – отличия показателей ГИ и ГИ 2, p < 0,05; ▪ – отличия показателей ГИ 1 и ГИ 2, p < 0,05.

Figure 3. Changes in the phagocytic activity of neutrophil granulocytes before and after cultivation in vitro with immunoregulatory peptides in acute hematogenous osteomyelitis in children

Note. *, differences in indicators between the comparison group (CG) and the study group (SG), p < 0.05; ^, differences between SG and SG 1 indicators, p < 0.05; #, differences between SG and SG 2 indicators, p < 0.05; ▪, differences between SG 1 and SG 2, p < 0.05.

 

Под действием ГМДП также наблюдалось повышение %ФАГ 63,0 (52,0-65,0) % и %П 63,0 (59,3-66,9) до показателей ГС (р < 0,05) (рис. 3).

Полученные результаты экспериментального исследования очередной раз показывают функциональную гибкость НГ и модулирующую роль ГП и ГМДП на популяции НГ СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- и СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺, что дает возможность использовать иммунорегуляторные пептиды для восстановления дисфункций НГ.

Под влиянием ГМДП отмечается значимое повышение МFI CD 66b и МFI CD33 рецепторов (р_{1, 2} < 0,05) в обеих субпопуляциях, отмечается тенденция повышения МFI HLA-DR (p > 0,05) на субпопуляции НГ-АПК. Роль CD33 на НГ малоизучена. Однако показано, что CD33 связываясь с ITAM, содержащими CD16 рецепторами, ингибирует цитотоксическую активность NK-лимфоцитов [6].

Эффекты влияния ГП в большей мере проявляются в отношении изменения фенотипа субпопуляции НГ – АПК. Отмечается повышение плотности экспрессии MFI CD66b (р < 0,05), снижение MFI CD16 (р < 0,05) и MFI HLA-DR (p > 0,05).

Модулирующие эффекты ГП и ГМДП на фенотип субпопуляций НГ СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ и СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- приводят к восстановлению фагоцитарной функции НГ. Под влиянием ГП и ГМДП увеличение MFI молекулы CD66b (р_{1, 2} < 0,05), что способствует улучшению хемотаксиса и адгезивных свойств НГ, необходимых для реализации эффекторных функций. Кроме того, ГП статистически значимо уменьшает MFI CD16, снижая гиперактивацию клеток, направленную на цитотоксическую активность, дегрануляцию и формирование NEТs.

Заключение

Факт детекции в ПК детей с ОГО субпопуляции «долгоживущих» активированных НГ с фенотипом СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺, со свойствами АПК, представляющих АГ T-лимфоцитам, оставляет перед исследователями нерешенный вопрос: будет ли такая трансформация способствовать или замедлять прогрессирование гнойно-воспалительного процесса. В любом случае, выявленные различные эффекты иммунотропных пептидов в системе in vitro демонстрируют возможность модулировать фенотип субпопуляции НГ-АПК, способствуя восстановлению эффекторных функции НГ.

About the authors

I. V. Nesterova

Kuban State Medical University; P. Lumumba Peoples’ Friendship University of Russia

Email: chudilova2015@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Chief Researcher, Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology, Central Scientific Research Laboratory; Professor, Department of Clinical Immunology, Allergology and Adaptology, Faculty of Continuing Medical Education, Medical Institute

Russian Federation, Krasnodar; Moscow

G. A. Chudilova

Kuban State Medical University

Email: chudilova2015@yandex.ru

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head, Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology, Central Research Laboratory, Professor, Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics

Russian Federation, Krasnodar

Yu. V. Teterin

Kuban State Medical University

Author for correspondence.
Email: chudilova2015@yandex.ru

Postgraduate Student, Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics

Russian Federation, Krasnodar

References

Supplementary files