НОВЫЙ ПОДХОД К АНАЛИЗУ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА Т-ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

Резюме

Способность Т-лимфоцитов к интенсивной пролиферации является основой формирования как естественного, так и поствакцинального иммунитета. Соответственно, нарушение деления Т-клеток может отражаться на восприимчивости человека к заболеваниям и эффективности вакцинации. Подход, который позволит определять не только долю делящихся клеток и активность пролиферации, но и фазы клеточного цикла, значительно расширит возможности исследования причин и механизмов нарушения деления Т-лимфоцитов.

Цель. Апробировать новый подход к анализу клеточного цикла Т-лимфоцитов разной степени зрелости с использованием проточной цитометрии.

Материалы и методы. Объектом исследования служила периферическая кровь, полученная от здоровых доноров. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности диаколла стандартным методом и стимулировали фитогемагглютинином, после чего культивировали в течение 4 суток (37^оС, 5 % CO₂). Активированные лейкоциты окрашивали витальным красителем LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain и антителами CD3 BV605, CD4 PE, CD8 BV510, CCR7 PE/Cy7 и CD45RO APC-eF780. Клетки фиксировали и пермеабилизировали, после чего окрашивали антителами к pRb AF488 и pHH3 AF647, а также красителем DAPI. Анализ клеток проводили на проточном цитометре CytoFLEX S.

Результаты. Установлено, что предложенный подход позволяет различать Т-лимфоциты, находящиеся в G0, G1, S, G2 и M-фазах клеточного цикла. Более того, разработанная панель флуоресцентных красителей и антител позволяет одновременно идентифицировать CD4+ и CD8+ Т-клетки различной степени зрелости. Так, в пилотном исследовании было установлено количество CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, вступивших в активные фазы клеточного цикла, и особенности их распределения по фазам. Также были выявлены отличия паттернов пролиферации наивных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, соответствующих клеток центральной и эффекторной памяти, а также терминальных эффекторов.

Выводы. Предложенный метод позволяет проводить комплексный анализ клеточного цикла CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов разной степени зрелости с использованием проточной цитометрии.