Novel approach to cell cycle analysis of T lymphocytes using flow cytometry

Full Text

Введение

Т-лимфоциты играют важную роль в адаптивном иммунном ответе, обеспечивая защиту от инфекций, опухолей и аутоиммунных заболеваний. Способность этих клеток циркулировать в организме в течение продолжительного времени и резко увеличивать свое количество при столкновении с патогеном является основой формирования стойкого поствакцинального иммунитета [6, 7, 11]. Соответственно, нарушение деления Т-лимфоцитов может отражаться на эффективности вакцинации и способности противостоять заболеваниям различного генеза.

В настоящее время для изучения пролиферации Т-лимфоцитов применяются несколько подходов, задействующих проточную цитометрию. Первый – окрашивание клеток 5(6)-карбоксифлуоресцеин диацетат-N-сукцинимидиловым эфиром (CFSE) или его аналогами [2]. Эти флуоресцентные красители способны проникать внутрь клеток и образовывать стабильные ковалентные связи с аминогруппами белков. При каждом делении меченные красителем родительские белки равномерно распределяются между дочерними лимфоцитами. Это приводит к дискретному снижению интенсивности флуоресценции, что позволяет отслеживать количество делений клеток. Второй подход – добавление в среду для культивирования аналога тимидина 5-бромо-2'-дезоксиуридина (BrdU) [9]. Пролиферирующие лимфоциты включают его в состав ДНК дочерних клеток во время синтеза новой цепи (S-фаза клеточного цикла), что позволяет идентифицировать активно делящиеся клетки по наличию в их генетическом материале синтетического нуклеотида. Для обнаружения инкорпорированного BrdU используются меченые флуорохромами моноклональные антитела. Этот подход позволяет определить долю пролиферирующих клеток в популяции и проанализировать количество клеток в S-фазе. Третий подход – детекция внутриклеточных и поверхностных белков, характерных для делящихся иммуноцитов [8]. Такие молекулы, как Ki-67 и CD71, экспрессируются в активных фазах клеточного цикла и не присутствуют на покоящихся лимфоцитах [1]. Для детекции эти белки также окрашивают флуоресцентными моноклональными антителами. Метод позволяет оценить количество пролиферирующих Т-лимфоцитов. Четвертый подход – оценка содержания нуклеиновых кислот в пролиферирующих клетках с использованием флуоресцентных красителей, способных связываться с двуспиральной ДНК пропорционально ее количеству, таких как 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) [5]. Так как в процессе деления содержание ДНК временно увеличивается, метод позволяет отличить клетки с диплоидным набором хромосом (2n) от клеток, удвоивших их количество в процессе митоза (4n).

Несмотря на разнообразие, вышеописанные подходы не позволяют оценить эффективность прохождения клетками отдельных фаз клеточного цикла. Более того, не каждая методология дает возможность идентифицировать субпопуляционную принадлежность анализируемых клеток. Наличие метода, позволяющего единовременно анализировать фенотип и фазу клеточного цикла, значительно расширит возможности исследователей.

Цель настоящей работы – апробировать новый подход к анализу клеточного цикла Т-лимфоцитов методом проточной цитометрии.

Материалы и методы

Объектом исследования служили мононуклеарные клетки, полученные от относительно здоровых доноров крови (n = 3). Проведение исследования было одобрено этическим комитетом ИЭГМ УрО РАН (рег. № комитета IRB00010009). Каждый участник подписал информированное согласие.

Кровь объемом до 10 мл забирали натощак из кубитальной вены в вакуумные пробирки, содержащие литий гепарин (Weihai Hongyu Medical Devices Cj., Ltd, Китай).

Мононуклеарные клетки выделяли путем центрифугирования двукратно разведенной фосфатно-солевым буферным раствором Дульбекко (DPBS, Gibco, США) крови в градиенте плотности Диаколла (1,077 г/мл, ООО «Диаэм», Россия). Выделенные клетки собирали, дважды отмывали раствором DPBS, подсчитывали в камере Горяева.

Выделенные клетки стимулировали фитогемагглютинином (ФГА, Serva, Германия) в конечной концентрации 15 мкг/мл. Лейкоциты культивировали в 96-луночных планшетах (Costar, США) в полной питательной среде (ППС), содержащей RPMI-1640 (BioinnLabs, Россия), 10% ЭТС, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific, Inc., США), в течение 4 суток (37 °С, 5% СО2). По окончании времени инкубации клетки собирали и для фенотипического анализа окрашивали витальным красителем LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain (LD, Life Technologies, США) и коктейлем анти-CD3-BV605, анти-CD4-PE, анти-CD8-BV510, анти-CCR7-PE/Cy7 (BioLegend, США) и анти-CD45RO-APC-eF780 (Invitrogen, США) антител. После этого образцы фиксировали холодным раствором Fixation Buffer (BioLegend, США) в течение 20 мин в темноте и дважды отмывали избыточным объемом раствора DPBS, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma-Aldrich, США). Зафиксированные клетки пермеабилизировали с использованием True-Phos Perm Buffer (BioLegend, США) в течение 1 ч и дважды отмывали избыточным объемом DPBS/1% BSA. Пробы окрашивали DAPI (BioLegend, США), анти-pRb-AF488 (BD Biosciences, США) и анти-pHH3-AF647 (BioLegend, США) антителами. Окрашенные клетки анализировали с использованием проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США).

Визуализацию данных проводили с помощью программного обеспечения FlowJo 10.3 (FlowJo LLC, США).

Результаты и обсуждение

Лейкоциты гейтировали последовательно. По параметрам прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния выделяли регион лимфоцитов. Затем внутри этого региона выделяли клетки, умеренно окрашенные витальным красителем. Интенсивно окрашенные – «мертвые» клетки, мембрана которых ввиду повреждений допустила проникновение красителя – вносят погрешность в получаемые результаты [10] и потому были исключены из анализа. Среди оставшихся жизнеспособных клеток по наличию поверхностной молекулы CD3 идентифицировали Т-лимфоциты.

Один из существующих вариантов оценки пролиферации Т-лимфоцитов предполагает окраску интеркалирующими красителями, такими как DAPI. Этот краситель, связываясь с AT-кластерами в малой бороздке двухцепочечной ДНК, флуоресцирует после облучения лазером. Яркость свечения пропорциональна количеству связавшегося красителя и, следовательно, содержанию ДНК в клетке. Лимфоциты с набором 4n (G2- и M-фазы клеточного цикла) светятся в два раза ярче, чем клетки с содержанием ДНК 2n (G0- и G1-фазы). Промежуточной флуоресценцией характеризуются клетки, находящиеся в S-фазе клеточного цикла (рис. 1).

 

Рисунок 1. Традиционный и предлагаемый подход к анализу клеточного цикла Т-лимфоцитов

Figure 1. Traditional and proposed approaches to analyzing the T lymphocyte cell cycle

 

Для того чтобы отделить G0- от G1- и G2- от M-фазы клеточного цикла, нами было предложено ввести два дополнительных маркера: фосфорилированный белок ретинобластомы (pRb) и фосфорилированный гистон H3 (pHH3). Белок ретинобластомы фосфорилируется при переходе клеток в активные фазы клеточного цикла [3], следовательно, лимфоциты в G1-, S-, G2- и M-фазах имеют фенотип pRb+. Полученные нами данные показали, что гейтирование pRb требует введения дополнительного контроля (флуоресценция минус один, FMO) для точного определения границы региона. В свою очередь, гистон H3 фосфорилируется при переходе из G2- в M-фазу клеточного цикла [4]. Согласно полученным нами результатам, уровень экспрессии pHH3 достаточно высок и не требует введения дополнительных контролей.

Предлагаемый метод оценки фаз клеточного цикла был апробирован на CD4+ и CD8+Т-лимфоцитах различной степени зрелости: CCR7+CD45RO- – наивные лимфоциты; CCR7+CD45RO+ – клетки центральной памяти; CCR7-CD45RO+ – клетки эффекторной памяти; CCR7-CD45RO- – терминально дифференцированные элементы. В результате было показано следующее. Приблизительно равное число CD4+ и CD8+Т-клеток экспрессирует pRb после 4 суток культивирования с ФГА: 22,5% и 20,5% соответственно. При этом было отмечено неодинаковое распределение CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов по фазам клеточного цикла (табл. 1). Так, основная часть CD4+Т-клеток была представлена лимфоцитами в G1-фазе. Напротив, для CD8+Т-лимфоцитов было характерно более равномерное распределение между G1, S и G2-фазами. По-видимому, это отражает более высокую митотическую активность цитотоксических Т-лимфоцитов по сравнению с хелперными клетками.

 

Таблица 1. Распределение стимулированных Т-лимфоцитов по фазам клеточного цикла

Table 1. The distribution of stimulated T lymphocytes across cell cycle phases

Фаза клеточного цикла Cell cycle phase	CD4+Т-клетки CD4+T cells	CD8+Т-клетки CD8+T cells
G1-фаза, % G1 phase, %	87,7	41,7
S-фаза, % S phase, %	9,7	31,6
G2-фаза, % G2 phase, %	0,3	20,7
M-фаза, % M phase, %	0,01	2,8

 

Среди CD4+Т-лимфоцитов в каждой исследованной нами субпопуляции распределение клеток между фазами клеточного цикла было единообразным и совпадало с таковым в общем пуле. В то же время среди субпопуляций CD8+Т-лимфоцитов был выявлен ряд особенностей. Так, большинство клеток, находящихся в M-фазе, было представлено в субпопуляциях эффекторной памяти и терминально-дифференцированных клеток (в среднем 9,8%). Среди наивных лимфоцитов и клеток центральной памяти их количество было существенно ниже и в среднем составило 0,8%. При этом в S-фазе клеточного цикла пул лимфоцитов, относящихся к наивным и центральной памяти, был увеличен по сравнению с таковым у более дифференцированных форм (в среднем 35,2% против 22,7%). Полученные результаты подтверждают сделанное ранее предположение о более высокой, чем у CD4+Т-лимфоцитов митотической активности CD8+Т-клеток. Более того, в пуле цитотоксических Т-лимфоцитов, по-видимому, интенсивно делятся более зрелые элементы: клетки эффекторной памяти и терминально-дифференцированные лимфоциты.

Выводы

Предлагаемый метод позволяет проводить оценку фаз клеточного цикла в CD4+ и CD8+Т-лимфоцитах разной степени зрелости. Метод может быть весьма информативен при изучении того, как различные субпопуляции Т-клеток реагируют на антигенную стимуляцию, какие факторы влияют на их пролиферацию и как эти процессы связаны с формированием иммунной памяти. Это может внести вклад в понимание механизмов формирования поствакцинального и противоопухолевого иммунитета.

Благодарности

В работе использовано оборудование ЦКП «Исследования материалов и вещества» ПФИЦ УрО РАН. Автор выражает глубокую благодарность младшему научному сотруднику лаборатории молекулярной иммунологии ИЭГМ УрО РАН Власовой В.В. и научному сотруднику лаборатории экологической иммунологии ИЭГМ УрО РАН Королевской Л.Б.

About the authors

Evgeniya V. Saidakova

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: radimira@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-4342-5362
SPIN-code: 8927-1127

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files