Оценка диагностической значимости цитокинов и микроРНК у доношенных новорожденных с врожденными пороками сердца в качестве биомаркеров некротизирующего энтероколита

Полный текст

Введение

Новорожденные с дуктус-зависимыми врожденными пороками сердца (ВПС) находятся в группе повышенного риска развития некротизирующего энтероколита (НЭК) – тяжелого воспалительного заболевания кишечника. Клиническое течение дуктус-зависимых ВПС сопровождается гемодинамической нестабильностью, гипоксией, прогрессирующей сердечно-сосудистой недостаточностью, что является показанием для кардиохирургической коррекции в первые недели жизни. Частота развития НЭК у детей с ВПС, перенесших кардиохирургическое лечение, достигает 61%, а летальность – 24% [5].

Молекулярные механизмы патогенеза НЭК у новорожденных с ВПС мало изучены. Считается, что развитие НЭК у таких детей в основном ассоциировано с гипоперфузией и ишемией кишечника, системным воспалением, что приводит к продукции широкого спектра цитокинов, активации иммунных клеток, нарушению целостности эпителиального барьера и некрозу [11]. В последние годы в качестве сигнальных молекул, участвующих в патогенезе НЭК, рассматривают некодирующие регуляторные микроРНК (miR), регулирующие различные биологические процессы, в том числе воспаление, дифференцировку, активацию, хемотаксис и апоптоз иммунных клеток, посредством посттранскрипционной регуляции экспрессии генов.

Учитывая неспецифичность клинических проявлений при дебюте заболевания, высокую летальность и отсутствие специфической лабораторной диагностики, актуальной задачей является поиск специфических биомаркеров, позволяющих выявлять заболевание на ранних стадиях.

Цель исследования – оценить диагностический потенциал уровней цитокинов и микроРНК в плазме крови новорожденных с дуктус-зависимыми ВПС в качестве специфических биомаркеров НЭК.

Материалы и методы

В когортное исследование было включено 38 доношенных новорожденных (массой тела > 2500 г и сроком гестации > 37 нед.) с ВПС, родившихся и перенесших кардиохирургическое лечение на 8-е (6-12) сутки жизни в ФГБУ «НМИЦ им В.А. Алмазова» в 2019-2020 гг. На 3-и (1-5) сутки после операции у 10 новорожденных на основе клинических симптомов, рентгенологических и лабораторных данных был диагностирован НЭК (стадия IIA – 9 детей, IIIA – 1 ребенок, согласно классификации M. Bell в модификации M. Walsh и R. Kliegman).

Исследование было выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено этическим комитетом Национального медицинского исследовательского центра им. В.А. Алмазова (протокол № 1702-21 от 15 февраля 2021). Письменное информированное согласие было получено от родителей всех новорожденных, включенных в исследование.

Взятие образцов периферической крови осуществляли в стерильные пробирки с К3-ЭДТА на 6-е (5-7-е) сутки после операции. Образцы плазмы крови получали двухэтапным центрифугированием цельной крови, при 1500g в течение 15 минут и хранили при температуре -40 °C до использования.

Определение уровней (пг/мл) интерлейкинов IL-1α, IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-12p40, IL- 12p70, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-17E/IL-25, IL- 17F, IL-18, IL-22, IL-27 и факторов роста G-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов), M-CSF (макрофагальный колониестимулирующий фактор), GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), VEGF-A (васкулоэндотелиальный фактор роста), PDGF-AA, AB/BB (факторы роста тромбоцитов), FGF-2 (фактор роста фибробластов-2), EGF (эпидермальный фактор роста) и TGFα (трансформирующий фактор роста) в образцах плазмы крови, полученных от 28 новорожденных без НЭК и 10 новорожденных с НЭК, проводили с использованием набора MILLIPLEX Human Cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A (MilliporeSigma, США) на приборе MAGPIX (Luminex, США).

Выделение РНК из образцов плазмы крови, полученных от 14 новорожденных без НЭК и 10 новорожденных с НЭК, проводили реагентом TRIzol LS (Thermo Fisher Scientific, США) с добавлением внешнего синтетического контроля cel-miR-39-3p для последующей нормализации данных, как описано ранее [8]. Определение уровней экспрессии микроРНК-155-5р, микроРНК-221-3р и микроРНК-451а проводили наборами The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, США) и TaqMan MicroRNA Assays (Assay ID 002623, 000524, 001141 и 000200) (Life Technologies, США). Для расчета применяли метод 2-ΔΔCt.

Статистическую обработку данных выполняли в программах Statistica 10.0 (StatSoft, США), MedCalc 23.0.2 (MedCalc Software Ltd, Бельгия) и Prism 9 (GraphPad, США). Качественные показатели представляли в виде абсолютных (n) и относительных (%) частот, количественные – в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q0,25-Q0,75). Статистическую значимость различий качественных переменных оценивали точным критерием Фишера, количественных – U-критерием Манна–Уитни. Оценку диагностической значимости биомаркеров проводили методом анализа ROC-кривых, рассчитывая значение площади под кривой (ППК) и пороговый уровень по индексу Юдена. Для разработки диагностических моделей применяли метод логистической регрессии. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Статистический анализ не выявил достоверных отличий по полу, гестационному возрасту, весу при рождении, оценке Апгар, пороку сердца и по стандартным лабораторным показателям между новорожденными с ВПС и новорожденными с ВПС + НЭК (табл. 1).

 

Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика доношенных новорожденных с дуктус-зависимыми ВПС в зависимости от развития НЭК в послеоперационном периоде

Table 1. Clinical and laboratory characteristics of term newborns with ductus-dependent congenital heart defects depending on the NEC development in the postoperative period

Параметры / Parameters		ВПС / CHD (n = 28)	ВПС + НЭК / CHD + NEC (n = 10)	p
Клинические данные / Clinical data
Пол Sex	Девочка (11) Girl (11)	10 (36%)	1 (10%)	0,225
	Мальчик (27) Boy (27)	18 (64%)	9 (90%)
Гестационный возраст, недели (38) Gestational age, wk (38)		39 (38-40)	39 (38-39)	0,334
Вес при рождении, г (38) Birth weight, g (38)		3495 (3000-3815)	3235 (3020-3620)	0,334
Оценка по Апгар на 1-й минуте (38) Apgar score at the 1st minute (38)		7 (7-7)	7 (7-7)	1,0
Оценка по Апгар на 5-й минуте (38) Apgar score at the 5th minute (38)		8 (7-8)	8 (8-8)	0,286
Порок сердца Heart defect	Цианотический (25) Cyanotic (25)	18 (64%)	7 (70%)	1,0
	Ацианотический (13) Acyanotic (13)	10 (36%)	3 (30%)
Лабораторные показатели / Laboratory parameters
Гемоглобин, г/л Hemoglobin, g/L		134 (119-149)	123 (109-143)	0,334
Эритроциты, × 1012/л Erythrocytes, × 1012/L		4,3 (3,8-4,8)	4,0 (3,6-4,9)	0,482
Тромбоциты, × 109/л Platelets, × 109/L		325 (210-472)	302 (232-421)	0,660
Лейкоциты, × 109/л Leukocytes, × 109/L		12,8 (11,5-15,4)	11,3 (8,5-19,4)	0,613
Палочкоядерные нейтрофилы, % Band neutrophils, %		1,0 (0,5-3,0)	1,0 (1,0-2,0)	0,404
Сегментоядерные нейтрофилы, % Segmented neutrophils, %		56,5 (45,5-64,5)	50,0 (44,0-58,0)	0,442
Эозинофилы, % Eosinophils, %		3,0 (1,5-6,5)	5,0 (0,0-10,0)	0,935
Лимфоциты, % Lymphocytes, %		25,0 (16,0-32,0)	23,5 (14,0-30,0)	0,660
С-реактивный белок, мг/л C-reactive protein, mg/L		9,1 (5,5-19,7)	4,9 (2,8-18,0)	0,194
Иммунологические показатели / Immunological parameters
IL-8, пг/мл IL-8, pg/mL		5,87 (4,39-10,06)	9,18 (7,36-20,51)	0,037
M-CSF, пг/мл M-CSF, pg/mL		5,71 (0,00-61,62)	71,71 (47,47-152,14)	0,006
miR-451a, у. е. miR-451a, c. u.		0,25 (0,12-0,55)	0,05 (0,02-0,11)	0,014

Примечание. Достоверность различий качественных переменных оценивали точным критерием Фишера, количественных – по U-критерию Манна–Уитни – p < 0,05

Note. The reliability of differences in qualitative variables was assessed using Fisher’s exact test, and quantitative variables were assessed using the Mann–Whitney U test, p < 0.05.

 

Анализ уровня 31 цитокина плазмы крови показал, что IL-1β, IL-3, IL-22 и GM-CSF в более 80% образцов имели значения ниже определяемого уровня. Среди оставшихся 27 цитокинов только уровни IL-8 и M-CSF были статистически значимо выше в 1,6 (р = 0,037) и 12,6 (р = 0,006) раз соответственно, у новорожденных с ВПС + НЭК по сравнению с новорожденными с ВПС без НЭК (табл. 1).

IL-8 – провоспалительный хемокин, ключевая роль которого состоит в привлечении нейтрофилов в очаг воспаления [2]. M-CSF регулирует поляризацию макрофагов в сторону противовоспалительного фенотипа, а также стимулирует дифференцировку и созревание ворсинок кишечника, удлиняя их поверхность [3, 10]. Таким образом, можно предположить, что повышение уровня IL-8 у новорожденных с ВПС + НЭК может влиять на более активное привлечение нейтрофилов в очаг воспаления, формирование нейтрофильных ловушек и усиление воспалительного ответа; а высокий уровень M-CSF за счет стимуляции роста ворсинок кишечника может способствовать увеличению области воспаления. Повышение уровня IL-8 у недоношенных новорожденных в раннем неонатальном периоде было также ассоциировано с риском развития НЭК [1].

Анализ уровня экспрессии микроРНК в образцах плазмы крови показал, что две группы новорожденных отличались друг от друга только по уровню экспрессии miR-451a, которая была в 5 раз ниже (р = 0,014) у новорожденных с НЭК (табл. 1).

МiR-451 является важнейшим регулятором многочисленных сигнальных путей, в том числе участвует в эритропоэзе и модулирует продукцию цитокинов дендритными клетками [9]. На мышиной модели ревматоидного артрита установлено, что повышенные уровни miR-451a ингибируют хемотаксис нейтрофилов [6]. На клетках микроглии доказано, что miR-451a оказывает противовоспалительные эффекты посредством ингибирования NLRP3-индуцированных провоспалительных каскадов [4]. Таким образом, можно предположить, что высокий уровень miR- 451a снижает воспаление и может служить защитным механизмом против развития НЭК у доношенных новорожденных с ВПС.

Повышенный уровень miR-451 был обнаружен в тканях кишечника недоношенных новорожденных с НЭК [7]. Учитывая, что у недоношенных, кишечник функционально незрелый, молекулярные механизмы НЭК у доношенных новорожденных с ВПС могут значительно отличаться от таковых у недоношенных новорожденных, а повышенные уровни miR-451, у недоношенных новорожденных, вероятно, связаны с продолжающимся формированием функционально зрелого кишечника.

С целью определения диагностической значимости идентифицированных биомаркеров был проведен ROC-анализ, с определением пороговых уровней и соответствующих им значений чувствительности и специфичности (рис. 1). Наибольшую диагностическую ценность продемонстрировала модель, включающая все 3 биомаркера (ППК = 0,901, с чувствительностью 85,7% и специфичностью 84,6%. Тогда как модель, включающая только цитокины IL-8 и M-CSF, имела уровень ППК = 0,793 с чувствительностью 90,0%, но низкой специфичностью – 64,3%.

 

Рисунок 1. ROC-анализ уровней IL-8, M-CSF, miR-451a и их комбинации у доношенных новорожденных с ВПС и ВПС + НЭК

 

Выводы

Модель, включающая три биомаркера miR- 451a, IL-8 и M-CSF, обладает высоким диагностическим потенциалом (ППК = 0,901 с чувствительностью 85,7% и специфичностью 84,6%) для диагностики НЭК в рутинной клинической практике.

Об авторах

Е. К. Зайкова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова» Министерства здравоохранерия РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: Catherine3452@yandex.ru

младший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории микровезикулярного сигналинга Института молекулярной биологии и генетики 

Россия, Санкт-Петербург

А. В. Каплина

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова» Министерства здравоохранерия РФ

Email: Catherine3452@yandex.ru

младший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории физиологии и патологии новорожденных Института перинатологии и педиатрии, врач-неонатолог отделения физиологии новорожденных с палатой интенсивной терапии Клиники материнства и детства 

Россия, Санкт-Петербург

Н. А. Петрова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова» Министерства здравоохранерия РФ

Email: Catherine3452@yandex.ru

кандидат медицинских наук, доцент, заведующий научно-исследовательской лаборатории физиологии и патологии новорожденных Института перинатологии и педиатрии 

Россия, Санкт-Петербург

Татьяна Михайловна Первунина

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова» Министерства здравоохранерия РФ

Email: Catherine3452@yandex.ru

доктор медицинских наук, профессор, директор Института перинатологии и педиатрии 

Россия, Санкт-Петербург

А. А. Костарева

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова» Министерства здравоохранерия РФ

Email: Catherine3452@yandex.ru

доктор медицинских наук, профессор кафедры факультетской терапии с клиникой Института медицинского образования, директор Института молекулярной биологии и генетики 

Россия, Санкт-Петербург

О. В. Калинина

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова» Министерства здравоохранерия РФ; ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»

Email: Catherine3452@yandex.ru

доктор биологических наук, профессор кафедры лабораторной медицины с клиникой Института медицинского образования, ведущий научный сотрудник Института молекулярной биологии и генетики, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и эволюционной генетики 

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы