CCR6⁺CXCR3^-CD8⁺Т-лимфоциты периферической крови в патогенезе рецидивирующе-ремиттирующего рассеянного склероза

Полный текст

Введение

CD8⁺T-лимфоциты являются весьма гетерогенной группой клеток, функции которых связаны не только с индукцией апоптоза в клетках-мишенях, но и с продукцией широкого спектра иммунорегуляторных молекул при различного рода патологических процессах [1, 11]. В настоящее время общий пул CD8⁺Т-клеток принято разделять три ключевых подтипа – Tc1, Tc2 и Tc17, которые принимают участие в реализации воспалительных реакций по трем ключевым типам [1]. Подобно Th1-клеткам Tc1 CD8⁺Т-лимфоциты занимают ведущую роль в реализации воспалительных реакций по I типу за счет наличия выраженных цитолитических свойств, основанных на способности накапливать в цитоплазматических гранулах перфорин и гранзины, а также продукции эффекторных цитокинов IFNγ и TNFα [1]. Tc1 CD8⁺Т-лимфоциты экспрессируют на своей поверхности CCR5 и CXCR3, тогда как остальные хемокиновые рецепторы, свойственные Tc2, Tc17 и фолликулярным CD8⁺Т-лимфоцитам (CCR4, CCR6 и CXCR5 соответственно), на их клеточной мембране отсутствуют [6]. С другой стороны, в циркуляции также выявляют Tc2 и Tc17 CD8⁺Т-клетки, которые по спектру экспрессируемых транкпринционных факторов и секретируемых цитокинов схожи с Th2 и Th17 соответственно, но не обладают выраженными способностями уничтожать клетки-мишени [8]. По-видимому, баланс между цитолитическими Tc1, с одной стороны, и «цитокин-продуцирующими» популяциями Tc2 и Tc17, с другой, играет важную роль в развитии различных патологических состояний, включая аутоиммунные заболевания [11].

Рассеянный склероз (РС) – это хроническое прогрессирующее нейродегенеративное аутоиммунное заболевание нервной системы, которое характеризуется появлением в головном и спинном мозге диссеминированных очагов демиелинизации, в составе которых обнаруживаются различные популяции иммунных клеток, включая CD8⁺Т-лимфоциты [10]. Считается, что ведущую роль в запуске воспаления в нервной ткани играют Т-хелперы-1 (Th1) и Т-хелперы-17 (Th17), причем последние способны за счет синтеза и секреции IL-17 и IL-22 привлекать из кровотока различные клетки, включая нейтрофилы, и нарушать структуру плотных контактов клеток состав гемато-энцефалического барьера [2]. Как уже отмечалось выше, среди CD8⁺Т-клеток также присутствуют популяции лимфоцитов (Тс1 и Тс17), способные к продукции этих важных с точки зрения инициации повреждений нервно ткани цитокинов. Следует также отметить тот факт, что Tc17-клетки способны к продукции широкого спектра провоспалительных цитокинов, включая IL-5, IL-13, IL-17, IL-21, IL-22, IFNγ, TNFα и GM-CSF [6], которые играют важную роль в патогенезе РС. Однако в настоящее время обнаруживается лишь небольшое количество исследований, посвященных динамике различных субпопуляций «поляризованных» CD8⁺Т-клеток при РС. Поэтому в рамках собственного исследования нами был изучен субпопуляционный состав «поляризованных» CD8⁺Т-клеток, которые находились на различных стадиях созревания, у пациентов с РС.

Материалы и методы

Объектом исследования служила периферическая кровь, полученная от 25 пациентов с рецидивирующе-ремиттирующим течением РС (9 мужчин и 15 женщин; возраст 35 лет (27-41); баллы шкалы инвалидизации EDSS 2 (1,5-2,5); все пациенты не получали иммуносупрессивной терапии на момент получения образцов крови), и 24 условно здоровых добровольцев, соответствующих по полу и возрасту группе РС. Диагноз «РС» устанавливался на основании критериев МакДональда 2010 года. Исследование одобрено Комитетом по этике ФГБУН «Институт мозга человека им. Н.П. Бехтеревой» РАН 23.10.2014 и проводилось с информированного согласия пациентов.

В рамках подготовки образцов периферической крови для проточной цитометрии применялась следующая комбинация моноклональных антител против поверхностных антигенов человека: CD45RA (клон 2Н4, конъюгирован с FITC), CD62L (клон DREG56, конъюгирован с PE), CXCR5 (клон J252D4, конъюгирован с PerCP/ Cy5.5), CCR6 (клон G034E3, конъюгирован с Pe/Cy7), CXCR3 (клон G025H7, конъюгирован с APC), CD3 (клон OKT3, конъюгирован с APC/Cy7), CD8 (клон SK1, конъюгирован с Pacific Blue) и CCR4 (клон L291H4, конъюгирован с Brilliant Violet 510). Все антитела применялись в соответствие с рекомендациями производителя (производителем CD45RA и CD62L являлась компания Beckman Coulter, США; всех остальных антител – компания BioLegend, США). Для удаления эритроцитов использовали коммерческий буфер VersaLyse Lysing Solution (Beckman Coulter, США). По завершении разрушения эритроцитов (15 минут при комнатной температуре в темноте) образцы однократно отмывали (7 минут при 300g) избытком забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР, рН 7,2-7,4), после чего клеточный осадок ресуспендировали в 200 мкл свежего ЗФР с 2% нейтрального параформальдегида (Sigma-Aldrich, США). Сбор цитометрических данных осуществляли на проточной цитометре Navios 3/10 (Beckman Coulter, США), оснащенном программным обеспечением Navios Software 1.2 (Beckman Coulter, США). В каждом образце анализировалось не менее 30 000 CD8⁺Т-клеток периферической крови. Подготовка образцов для анализа, а также «тактика гейтирования» были описаны нами ранее [4].

Обработку данных цитометрии проводили при помощи Kaluza software v2.0 (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку осуществляли при помощи пакетов программ Statistica 8.0 (StatSoft, США) и GraphPad Prism 8 (GraphPad software, США). Результаты выражали в виде % позитивных клеток от искомой популяции или абсолютного содержания клеток в 1 мкл периферической крови (для этих целей применяли коммерческие частицы для абсолютного счета Flow-Count Fluorospheres (Beckman Coulter, США) в отдельной пробе), приводили в виде медианы и интерквартильного размаха – Me (Q_0,25-Q_0,75). Для оценки достоверности различий использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

С применением многоцветной проточной цитометрии в рамках общего пула CD8⁺Т-лимфоцитов периферической крови на основании анализа коэкспрессии хемокиновых рецепторов CXCR3 и CCR6 нами были выявлены четыре популяции клеток, в том числе Tc1 (CCR6^-CXCR3⁺), Tc2 (CCR6^-CXCR3^-), Tc17 (CCR6⁺CXCR3^-) и Tc17.1 (CCR6⁺CXCR3⁺). Было показано (рис. 1), при РС в периферической крови достоверно снижалось относительно содержание Тс1-клеток (с 71,35% (61,95-77,66) до 61,10% (54,47-64,89) при р = 0,001). Вместе с тем, как относительное, так и абсолютное содержание CCR6-позитивных клеток – Тс17 и Тс17.1 – достоверно возрастало относительно значений контрольной группы (в случае Тс17 с 0,76% (0,49-1,54) до 3,45% (2,36-5,06) и с 3 кл/1 μL (2-6) до 16 кл/1 μL (7-21) при р < 0,001 для обеих величин; а в случае Тс17.1 – с 3,56% (2,68-6,73) до 6,15% (4,85-9,56) при р = 0,015 и с 13 кл/1 μL (11-23) до 22 кл/1 μL (16-39) при р = 0,032).

 

Рисунок 1. Основные субпопуляции «поляризованных» CD8⁺Т-лимфоцитов периферической крови у пациентов с рассеянным склерозом

Примечание. Гистограммы А-Г – относительное содержание (% в рамках общего пула CD8⁺Т-клеток), гистограммы Д-З – абсолютное содержание (количество клеток в 1 мкл цельной крови) основных «поляризованных» популяций CD8⁺Т-лимфоцитов. Здесь и на рисунке 2: черным – пациенты с РС (MS, n = 25), белым – здоровый контроль (НС, n = 24). Результаты представлены в виде медианы и интерквантильного размаха – Me (Q_0,25-Q_0,75). Для полученных сравнения выборок использовали непараметрический критерий Манна–Уитни.

Figure 1. Alteration in relative and absolute numbers of major ‘polarized’ CD8⁺T cell subsets in patients with multiply sclerosis

Note. Scatter plots (A-D) and (E-H) show the percentages (% within total CD8⁺T cell subset) and absolute numbers (number of cells per 1 μL) Tc1, Tc2, Tc17 and Tc17.1 cells, respectively. Here and on the Figure 2: black circles denote patients with multiply sclerosis (MS, n = 25); white circles – healthy control (HC, n = 24). The data are presented as medians and quartile ranges: Me (Q_0.25-Q_0.75). The statistical analysis was performed with nonparametric Mann–Whitney U test.

 

В ходе дальнейших исследований в рамках общего пула CD8⁺Т-лимфоцитов на основании коэкспрессии CD45RA и CD62L были выявлены четыре основные стадии созревания CD8⁺Т-клеток, включая «наивные» (‘naive’) клетки с фенотипом CD45RA⁺CD62L⁺, клетки центральной (СМ) и эффекторной (ЕМ) памяти (с фенотипами CD45RA^-CD62L⁺ и CD45RA^-CD62L^- соответственно), а также зрелые эффекторные клетки популяции TEMRA (англ. effector memory cells re-expressing CD45RA). В рамках каждой из указанных выше популяций CD8⁺Т-клеток, находящихся на разных стадиях созревания, нами было определено относительное содержание Tc1-, Tc2-, Tс17- и Тс17.1-клеток, как это было описано ранее [3]. Было показано (рис. 2), что относительное содержание Tc1-клеток у пациентов с РС в периферической крови относительно значений контрольной группы (в случае «наивных» было снижено как в рамках популяций Т-клеток, которые «патрулировали» периферические лимфоидные органы – «наивные» клетки и клетки центральной памяти (с 76,67% (71,28-83,92) до 65,87% (61,87-75,24) при р < 0,001 и с 71,42% (63,08-80,43), до 67,46% (61,99-69,69) при p = 0,046 соответственно), так и среди ЕМ и TEMRA клеток, способных покадить кровоток и мигрировать в очаги воспаления локализованные в периферических тканях (с 69,20% (58,96-74,01) до 47,89% (37,97-55,38) при p < 0,001 и с 67,44% (53,68-74,78) до 49,75% (39,48-57,37) при р = 0,001 соответственно). Относительное содержание CCR6^-CXCR3^-Тс2-клеток при РС повышалось только в случае CD8⁺Т-клеток с фенотипом CD45RA⁺CD62L⁺ (30,28% (20,82-35,70) против 19,76% (14,81-26,40) в контроле при р = 0,001). При анализе уровня Тс17-клеток нами было отмечено достоверное увеличение процентного содержания данной популяции клеток на всех исследованных стадиях созревания CD8⁺Т-лимфоцитов, циркулировавших в периферической крови пациентов с РС (рис. 2). Причем различия с группой контроля особенно ярко проявлялись в случае популяций CD8⁺Т-лимфоцитов, способных мигрировать в воспаленные ткани – ЕМ и TEMRA (11,66% (4,75-14,69) против 2,45% (1,48-3,89) и 4,91% (3,68-8,63) против 0,41% (0,11-1,30) соответственно, при р < 0,001 для обеих популяций клеток). И, наконец, при исследовании Тс17.1 лимфоцитов, нами было отмечено, что уровень этих клеток возрастал у пациентов с РС относительно значений здорового контроля только в рамках клеток центральной памяти (8,97% (7,52-10,63) против 6,31% (4,79-8,91) при р = 0,031).

 

Рисунок 2. Нарушения в балансе Tc1, Tc2, Tc17 и Tc17.1-клеток в рамках субпопуляций CD8⁺Т-лимфоцитов периферической крови, находящихся на различных стадиях созревания, у пациентов с рассеянным склерозом

Примечание. Гистограммы А-Г, Д-З, И-М и Н-З – относительное содержание основных «поляризованных» популяций CD8⁺Т-лимфоцитов Tc1 (CCR6⁻CXCR3⁺), Tc2 (CCR6⁻CXCR3⁻), Tc17 (CCR6⁺CXCR3⁻) и Tc17.1 (CCR6⁺CXCR3⁺) в рамках «наивных» клеток (CD45RA⁺CCR7⁺), клеток центральной (CM, CD45RA⁻CCR7⁺) и эффекторной памяти (EM, CD45RA⁻CCR7⁻), а также эффекторных клеток популяции TEMRA (CD45RA⁺CCR7⁻), соответственно. См. примечание к рисунку 1.

Figure 2. Imbalance in peripheral blood Tc1, Tc2, Tc17, and Tc17.1 cells in maturation CD8⁺T cell subsets in patients with multiply sclerosis

Note. Scatter plots (A-D), (E-H), (I-L), and (M-P) present the relative numbers of Tc1 (CCR6⁻CXCR3⁺), Tc2 (CCR6⁻CXCR3⁻), Tc17 (CCR6⁺CXCR3⁻), and Tc17.1 (CCR6⁺CXCR3⁺) cells, respectively, within ‘naïve’ (CD45RA⁺CCR7⁺), central memory (CM, CD45RA⁻CCR7⁺), effector memory (EM, CD45RA⁻CCR7⁻), and terminally differentiated CD45RA-positive effector memory (TEMRA, CD45RA⁺CCR7⁻) CD8⁺T cells, respectively. See note to Figure 1.

 

В ходе проведенного исследования нами было отмечено увеличение уровня Тс17-клеток (как в относительных, так и в абсолютных величинах) в периферической крови пациентов с рецидивирующе-ремиттирующим течением РС относительно контрольных значений. Следует отдельно подчеркнуть, что наиболее выраженными эти изменения были в рамках популяций EM и TEMRA CD8⁺Т-клеток, способных покидать кровоток и мигрировать в очаги воспаления, что может указывать на непосредственной участие Тс17-клеток в воспалительных реакциях, протекающих в нервной ткани. Данные литературы указывают, что CD8⁺IFNγ⁺Tc1 и CD8⁺IL- 17⁺Tc17 увеличивались в периферической крови у пациентов как с рецидивирующе-ремиттирующим течением, так и со вторично-прогрессирующим РС в фазе рецидива [12]. Возможно, что накопление этих клеток в циркуляции именно в фазе рецидива РС может свидетельствовать о важности Тс17-клеток в патогенезе рассеянного склероза. Более того, с учетом способности Тс17-клеток к продукции ключевых провоспалительных цитокинов (IL-17, IL-21, IL-22, IFNγ, TNFα и GM- CSF) [6], играющих важную роль в развитии воспалительной реакции в нервной ткани при РС, данные клетки предсавляют весьма перспективную мишень для терапии. Подтверждением тому является тот факт, что некоторыми авторами было отмечено увеличение уровней Tc17-клеток в спинномозговой жидкости пациентов с РС по сравнению с их периферической кровью и по сравнению с спинномозговой жидкостью контрольных пациентов [14], а также F. Lolli и соавт. также выявили положительную корреляцию между уровнями Tc17 в спинномозговой жидкости и инвалидизацией пациентов, выраженной в баллах шкалы EDSS [5], что указывает на тесную связь между Tc17 и прогрессией данного заболевания. Более того, было показано, что на фоне терапии диметилфумаратом наблюдалось снижение Tc17, но не Th17 в периферической крови у пациентов с РС, что также было подтверждено на модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей [7]. Также C. Lückel и соавт. выявили, что повышенные уровень Tc17-клеток в циркуляции являлся одним из факторов ответа пациентов на терапию диметилфумаратом, тогда как у пациентов с низким содержанием Tc17 применение данного препараты было малоэффективным [7].

И наконец выявленное нами увеличение количества Тс17-клеток именно в рамках ЕМ и TEMRA популяций, способных секретировать высокие уровни цитотоксических молекул и провоспалительных цитокинов, свидетельствует в пользу активного участия CD8⁺Т-клеток в патогенезе РС, что было также предсказано другими исследователями [13]. Более того, накопление IL-17-продуцирующих и CD161⁺Тс17-клеток было свойственно для популяций активированных и эффекторных CD8⁺Т-клеток крови пациентов с рецидивирующе-ремиттирующим течением РС [9].

Выводы

При РС достоверно возрастает относительное и абсолютное содержание CXCR3^-CCR6⁺Tc17- и CXCR3⁺CCR6⁺Tc17.1-клеток в периферической крови. У пациентов с РС относительное содержание Тс1-клеток достоверно снижается, тогда как доля Тс17 возрастает на всех стадиях дифференцировки CD8⁺Т-клеток, включая «наивные» CD8⁺Т-клетки, CD8⁺Т-клетки центральной и эффекторной памяти, а также зрелые эффекторы популяции TEMRA. Все это указывает на важную роль Тс17-клеток в патогенезе РС, что может в дальнейшем применяться для разработки новых способов диагностики и терапии данного заболевания.

Об авторах

Валерий Михайлович Лебедев

ФГБУН «Институт мозга человека имени Н.П. Бехтеревой» Российской академии наук

Email: lebedevvaleriy@bk.ru

врач-невролог, заведующий отделением неврологии, младший научный сотрудник лаборатории направленной внутримозговой доставки препаратов

Россия, г. Санкт-Петербург

Ольга Михайловна Фролова

ФГБУН «Институт мозга человека имени Н.П. Бехтеревой» Российской академии наук

Email: dr.novoselova@gmail.com

врач-невролог, младший научный сотрудник лаборатории направленной внутримозговой доставки препаратов

Россия, г. Санкт-Петербург

Элеонора Александровна Старикова

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: Starickova@yandex.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории клеточной иммунологии

Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Дженнет Тумаровна Маммедова

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: jennet_m@mail.ru

научный сотрудник лаборатории клеточной иммунологии

Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Игорь Владимирович Кудрявцев

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Автор, ответственный за переписку.
Email: igorek1981@yandex.ru

к.б.н., заведующий лабораторией клеточной иммунологии

Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Список литературы

Дополнительные файлы