Peripheral blood CCR6⁺CXCR3^-CD8⁺T cells in pathogenesis of relapsing-remitting multiple sclerosis

Full Text

Введение

CD8⁺T-лимфоциты являются весьма гетерогенной группой клеток, функции которых связаны не только с индукцией апоптоза в клетках-мишенях, но и с продукцией широкого спектра иммунорегуляторных молекул при различного рода патологических процессах [1, 11]. В настоящее время общий пул CD8⁺Т-клеток принято разделять три ключевых подтипа – Tc1, Tc2 и Tc17, которые принимают участие в реализации воспалительных реакций по трем ключевым типам [1]. Подобно Th1-клеткам Tc1 CD8⁺Т-лимфоциты занимают ведущую роль в реализации воспалительных реакций по I типу за счет наличия выраженных цитолитических свойств, основанных на способности накапливать в цитоплазматических гранулах перфорин и гранзины, а также продукции эффекторных цитокинов IFNγ и TNFα [1]. Tc1 CD8⁺Т-лимфоциты экспрессируют на своей поверхности CCR5 и CXCR3, тогда как остальные хемокиновые рецепторы, свойственные Tc2, Tc17 и фолликулярным CD8⁺Т-лимфоцитам (CCR4, CCR6 и CXCR5 соответственно), на их клеточной мембране отсутствуют [6]. С другой стороны, в циркуляции также выявляют Tc2 и Tc17 CD8⁺Т-клетки, которые по спектру экспрессируемых транкпринционных факторов и секретируемых цитокинов схожи с Th2 и Th17 соответственно, но не обладают выраженными способностями уничтожать клетки-мишени [8]. По-видимому, баланс между цитолитическими Tc1, с одной стороны, и «цитокин-продуцирующими» популяциями Tc2 и Tc17, с другой, играет важную роль в развитии различных патологических состояний, включая аутоиммунные заболевания [11].

Рассеянный склероз (РС) – это хроническое прогрессирующее нейродегенеративное аутоиммунное заболевание нервной системы, которое характеризуется появлением в головном и спинном мозге диссеминированных очагов демиелинизации, в составе которых обнаруживаются различные популяции иммунных клеток, включая CD8⁺Т-лимфоциты [10]. Считается, что ведущую роль в запуске воспаления в нервной ткани играют Т-хелперы-1 (Th1) и Т-хелперы-17 (Th17), причем последние способны за счет синтеза и секреции IL-17 и IL-22 привлекать из кровотока различные клетки, включая нейтрофилы, и нарушать структуру плотных контактов клеток состав гемато-энцефалического барьера [2]. Как уже отмечалось выше, среди CD8⁺Т-клеток также присутствуют популяции лимфоцитов (Тс1 и Тс17), способные к продукции этих важных с точки зрения инициации повреждений нервно ткани цитокинов. Следует также отметить тот факт, что Tc17-клетки способны к продукции широкого спектра провоспалительных цитокинов, включая IL-5, IL-13, IL-17, IL-21, IL-22, IFNγ, TNFα и GM-CSF [6], которые играют важную роль в патогенезе РС. Однако в настоящее время обнаруживается лишь небольшое количество исследований, посвященных динамике различных субпопуляций «поляризованных» CD8⁺Т-клеток при РС. Поэтому в рамках собственного исследования нами был изучен субпопуляционный состав «поляризованных» CD8⁺Т-клеток, которые находились на различных стадиях созревания, у пациентов с РС.

Материалы и методы

Объектом исследования служила периферическая кровь, полученная от 25 пациентов с рецидивирующе-ремиттирующим течением РС (9 мужчин и 15 женщин; возраст 35 лет (27-41); баллы шкалы инвалидизации EDSS 2 (1,5-2,5); все пациенты не получали иммуносупрессивной терапии на момент получения образцов крови), и 24 условно здоровых добровольцев, соответствующих по полу и возрасту группе РС. Диагноз «РС» устанавливался на основании критериев МакДональда 2010 года. Исследование одобрено Комитетом по этике ФГБУН «Институт мозга человека им. Н.П. Бехтеревой» РАН 23.10.2014 и проводилось с информированного согласия пациентов.

В рамках подготовки образцов периферической крови для проточной цитометрии применялась следующая комбинация моноклональных антител против поверхностных антигенов человека: CD45RA (клон 2Н4, конъюгирован с FITC), CD62L (клон DREG56, конъюгирован с PE), CXCR5 (клон J252D4, конъюгирован с PerCP/ Cy5.5), CCR6 (клон G034E3, конъюгирован с Pe/Cy7), CXCR3 (клон G025H7, конъюгирован с APC), CD3 (клон OKT3, конъюгирован с APC/Cy7), CD8 (клон SK1, конъюгирован с Pacific Blue) и CCR4 (клон L291H4, конъюгирован с Brilliant Violet 510). Все антитела применялись в соответствие с рекомендациями производителя (производителем CD45RA и CD62L являлась компания Beckman Coulter, США; всех остальных антител – компания BioLegend, США). Для удаления эритроцитов использовали коммерческий буфер VersaLyse Lysing Solution (Beckman Coulter, США). По завершении разрушения эритроцитов (15 минут при комнатной температуре в темноте) образцы однократно отмывали (7 минут при 300g) избытком забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР, рН 7,2-7,4), после чего клеточный осадок ресуспендировали в 200 мкл свежего ЗФР с 2% нейтрального параформальдегида (Sigma-Aldrich, США). Сбор цитометрических данных осуществляли на проточной цитометре Navios 3/10 (Beckman Coulter, США), оснащенном программным обеспечением Navios Software 1.2 (Beckman Coulter, США). В каждом образце анализировалось не менее 30 000 CD8⁺Т-клеток периферической крови. Подготовка образцов для анализа, а также «тактика гейтирования» были описаны нами ранее [4].

Обработку данных цитометрии проводили при помощи Kaluza software v2.0 (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку осуществляли при помощи пакетов программ Statistica 8.0 (StatSoft, США) и GraphPad Prism 8 (GraphPad software, США). Результаты выражали в виде % позитивных клеток от искомой популяции или абсолютного содержания клеток в 1 мкл периферической крови (для этих целей применяли коммерческие частицы для абсолютного счета Flow-Count Fluorospheres (Beckman Coulter, США) в отдельной пробе), приводили в виде медианы и интерквартильного размаха – Me (Q_0,25-Q_0,75). Для оценки достоверности различий использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

С применением многоцветной проточной цитометрии в рамках общего пула CD8⁺Т-лимфоцитов периферической крови на основании анализа коэкспрессии хемокиновых рецепторов CXCR3 и CCR6 нами были выявлены четыре популяции клеток, в том числе Tc1 (CCR6^-CXCR3⁺), Tc2 (CCR6^-CXCR3^-), Tc17 (CCR6⁺CXCR3^-) и Tc17.1 (CCR6⁺CXCR3⁺). Было показано (рис. 1), при РС в периферической крови достоверно снижалось относительно содержание Тс1-клеток (с 71,35% (61,95-77,66) до 61,10% (54,47-64,89) при р = 0,001). Вместе с тем, как относительное, так и абсолютное содержание CCR6-позитивных клеток – Тс17 и Тс17.1 – достоверно возрастало относительно значений контрольной группы (в случае Тс17 с 0,76% (0,49-1,54) до 3,45% (2,36-5,06) и с 3 кл/1 μL (2-6) до 16 кл/1 μL (7-21) при р < 0,001 для обеих величин; а в случае Тс17.1 – с 3,56% (2,68-6,73) до 6,15% (4,85-9,56) при р = 0,015 и с 13 кл/1 μL (11-23) до 22 кл/1 μL (16-39) при р = 0,032).

 

Рисунок 1. Основные субпопуляции «поляризованных» CD8⁺Т-лимфоцитов периферической крови у пациентов с рассеянным склерозом

Примечание. Гистограммы А-Г – относительное содержание (% в рамках общего пула CD8⁺Т-клеток), гистограммы Д-З – абсолютное содержание (количество клеток в 1 мкл цельной крови) основных «поляризованных» популяций CD8⁺Т-лимфоцитов. Здесь и на рисунке 2: черным – пациенты с РС (MS, n = 25), белым – здоровый контроль (НС, n = 24). Результаты представлены в виде медианы и интерквантильного размаха – Me (Q_0,25-Q_0,75). Для полученных сравнения выборок использовали непараметрический критерий Манна–Уитни.

Figure 1. Alteration in relative and absolute numbers of major ‘polarized’ CD8⁺T cell subsets in patients with multiply sclerosis

Note. Scatter plots (A-D) and (E-H) show the percentages (% within total CD8⁺T cell subset) and absolute numbers (number of cells per 1 μL) Tc1, Tc2, Tc17 and Tc17.1 cells, respectively. Here and on the Figure 2: black circles denote patients with multiply sclerosis (MS, n = 25); white circles – healthy control (HC, n = 24). The data are presented as medians and quartile ranges: Me (Q_0.25-Q_0.75). The statistical analysis was performed with nonparametric Mann–Whitney U test.

 

В ходе дальнейших исследований в рамках общего пула CD8⁺Т-лимфоцитов на основании коэкспрессии CD45RA и CD62L были выявлены четыре основные стадии созревания CD8⁺Т-клеток, включая «наивные» (‘naive’) клетки с фенотипом CD45RA⁺CD62L⁺, клетки центральной (СМ) и эффекторной (ЕМ) памяти (с фенотипами CD45RA^-CD62L⁺ и CD45RA^-CD62L^- соответственно), а также зрелые эффекторные клетки популяции TEMRA (англ. effector memory cells re-expressing CD45RA). В рамках каждой из указанных выше популяций CD8⁺Т-клеток, находящихся на разных стадиях созревания, нами было определено относительное содержание Tc1-, Tc2-, Tс17- и Тс17.1-клеток, как это было описано ранее [3]. Было показано (рис. 2), что относительное содержание Tc1-клеток у пациентов с РС в периферической крови относительно значений контрольной группы (в случае «наивных» было снижено как в рамках популяций Т-клеток, которые «патрулировали» периферические лимфоидные органы – «наивные» клетки и клетки центральной памяти (с 76,67% (71,28-83,92) до 65,87% (61,87-75,24) при р < 0,001 и с 71,42% (63,08-80,43), до 67,46% (61,99-69,69) при p = 0,046 соответственно), так и среди ЕМ и TEMRA клеток, способных покадить кровоток и мигрировать в очаги воспаления локализованные в периферических тканях (с 69,20% (58,96-74,01) до 47,89% (37,97-55,38) при p < 0,001 и с 67,44% (53,68-74,78) до 49,75% (39,48-57,37) при р = 0,001 соответственно). Относительное содержание CCR6^-CXCR3^-Тс2-клеток при РС повышалось только в случае CD8⁺Т-клеток с фенотипом CD45RA⁺CD62L⁺ (30,28% (20,82-35,70) против 19,76% (14,81-26,40) в контроле при р = 0,001). При анализе уровня Тс17-клеток нами было отмечено достоверное увеличение процентного содержания данной популяции клеток на всех исследованных стадиях созревания CD8⁺Т-лимфоцитов, циркулировавших в периферической крови пациентов с РС (рис. 2). Причем различия с группой контроля особенно ярко проявлялись в случае популяций CD8⁺Т-лимфоцитов, способных мигрировать в воспаленные ткани – ЕМ и TEMRA (11,66% (4,75-14,69) против 2,45% (1,48-3,89) и 4,91% (3,68-8,63) против 0,41% (0,11-1,30) соответственно, при р < 0,001 для обеих популяций клеток). И, наконец, при исследовании Тс17.1 лимфоцитов, нами было отмечено, что уровень этих клеток возрастал у пациентов с РС относительно значений здорового контроля только в рамках клеток центральной памяти (8,97% (7,52-10,63) против 6,31% (4,79-8,91) при р = 0,031).

 

Рисунок 2. Нарушения в балансе Tc1, Tc2, Tc17 и Tc17.1-клеток в рамках субпопуляций CD8⁺Т-лимфоцитов периферической крови, находящихся на различных стадиях созревания, у пациентов с рассеянным склерозом

Примечание. Гистограммы А-Г, Д-З, И-М и Н-З – относительное содержание основных «поляризованных» популяций CD8⁺Т-лимфоцитов Tc1 (CCR6⁻CXCR3⁺), Tc2 (CCR6⁻CXCR3⁻), Tc17 (CCR6⁺CXCR3⁻) и Tc17.1 (CCR6⁺CXCR3⁺) в рамках «наивных» клеток (CD45RA⁺CCR7⁺), клеток центральной (CM, CD45RA⁻CCR7⁺) и эффекторной памяти (EM, CD45RA⁻CCR7⁻), а также эффекторных клеток популяции TEMRA (CD45RA⁺CCR7⁻), соответственно. См. примечание к рисунку 1.

Figure 2. Imbalance in peripheral blood Tc1, Tc2, Tc17, and Tc17.1 cells in maturation CD8⁺T cell subsets in patients with multiply sclerosis

Note. Scatter plots (A-D), (E-H), (I-L), and (M-P) present the relative numbers of Tc1 (CCR6⁻CXCR3⁺), Tc2 (CCR6⁻CXCR3⁻), Tc17 (CCR6⁺CXCR3⁻), and Tc17.1 (CCR6⁺CXCR3⁺) cells, respectively, within ‘naïve’ (CD45RA⁺CCR7⁺), central memory (CM, CD45RA⁻CCR7⁺), effector memory (EM, CD45RA⁻CCR7⁻), and terminally differentiated CD45RA-positive effector memory (TEMRA, CD45RA⁺CCR7⁻) CD8⁺T cells, respectively. See note to Figure 1.

 

В ходе проведенного исследования нами было отмечено увеличение уровня Тс17-клеток (как в относительных, так и в абсолютных величинах) в периферической крови пациентов с рецидивирующе-ремиттирующим течением РС относительно контрольных значений. Следует отдельно подчеркнуть, что наиболее выраженными эти изменения были в рамках популяций EM и TEMRA CD8⁺Т-клеток, способных покидать кровоток и мигрировать в очаги воспаления, что может указывать на непосредственной участие Тс17-клеток в воспалительных реакциях, протекающих в нервной ткани. Данные литературы указывают, что CD8⁺IFNγ⁺Tc1 и CD8⁺IL- 17⁺Tc17 увеличивались в периферической крови у пациентов как с рецидивирующе-ремиттирующим течением, так и со вторично-прогрессирующим РС в фазе рецидива [12]. Возможно, что накопление этих клеток в циркуляции именно в фазе рецидива РС может свидетельствовать о важности Тс17-клеток в патогенезе рассеянного склероза. Более того, с учетом способности Тс17-клеток к продукции ключевых провоспалительных цитокинов (IL-17, IL-21, IL-22, IFNγ, TNFα и GM- CSF) [6], играющих важную роль в развитии воспалительной реакции в нервной ткани при РС, данные клетки предсавляют весьма перспективную мишень для терапии. Подтверждением тому является тот факт, что некоторыми авторами было отмечено увеличение уровней Tc17-клеток в спинномозговой жидкости пациентов с РС по сравнению с их периферической кровью и по сравнению с спинномозговой жидкостью контрольных пациентов [14], а также F. Lolli и соавт. также выявили положительную корреляцию между уровнями Tc17 в спинномозговой жидкости и инвалидизацией пациентов, выраженной в баллах шкалы EDSS [5], что указывает на тесную связь между Tc17 и прогрессией данного заболевания. Более того, было показано, что на фоне терапии диметилфумаратом наблюдалось снижение Tc17, но не Th17 в периферической крови у пациентов с РС, что также было подтверждено на модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей [7]. Также C. Lückel и соавт. выявили, что повышенные уровень Tc17-клеток в циркуляции являлся одним из факторов ответа пациентов на терапию диметилфумаратом, тогда как у пациентов с низким содержанием Tc17 применение данного препараты было малоэффективным [7].

И наконец выявленное нами увеличение количества Тс17-клеток именно в рамках ЕМ и TEMRA популяций, способных секретировать высокие уровни цитотоксических молекул и провоспалительных цитокинов, свидетельствует в пользу активного участия CD8⁺Т-клеток в патогенезе РС, что было также предсказано другими исследователями [13]. Более того, накопление IL-17-продуцирующих и CD161⁺Тс17-клеток было свойственно для популяций активированных и эффекторных CD8⁺Т-клеток крови пациентов с рецидивирующе-ремиттирующим течением РС [9].

Выводы

При РС достоверно возрастает относительное и абсолютное содержание CXCR3^-CCR6⁺Tc17- и CXCR3⁺CCR6⁺Tc17.1-клеток в периферической крови. У пациентов с РС относительное содержание Тс1-клеток достоверно снижается, тогда как доля Тс17 возрастает на всех стадиях дифференцировки CD8⁺Т-клеток, включая «наивные» CD8⁺Т-клетки, CD8⁺Т-клетки центральной и эффекторной памяти, а также зрелые эффекторы популяции TEMRA. Все это указывает на важную роль Тс17-клеток в патогенезе РС, что может в дальнейшем применяться для разработки новых способов диагностики и терапии данного заболевания.

About the authors

Valeriy M. Lebedev

N. Bechtereva Institute of the Human Brain, Russian Academy of Sciences

Email: lebedevvaleriy@bk.ru

Neurologist, Head of the Neurology Department, Junior Researcher at the Laboratory of Targeted Intracerebral Drug Delivery

Russian Federation, St. Petersburg

Olga M. Frolova

N. Bechtereva Institute of the Human Brain, Russian Academy of Sciences

Email: dr.novoselova@gmail.com

Neurologist, Junior Researcher, Laboratory of Targeted Intracerebral Drug Delivery

Russian Federation, St. Petersburg

Eleonora A. Starikova

Institute of Experimental Medicine

Email: Starickova@yandex.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Cellular Immunology

Russian Federation, 12 Acad. Pavlov St, St. Petersburg, 197376

Jennet T. Mammedova

Institute of Experimental Medicine

Email: jennet_m@mail.ru

Researcher, Laboratory of Cellular Immunology

Russian Federation, 12 Acad. Pavlov St, St. Petersburg, 197376

Igor V. Kudryavtsev

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: igorek1981@yandex.ru

PhD (Biology), Head, Laboratory of Cellular Immunology

Russian Federation, 12 Acad. Pavlov St, St. Petersburg, 197376

References

Supplementary files