Влияние бактериоцинов на функции клеток врожденного иммунитета in vivo и in vitro

Полный текст

Введение

Кожа человека – это орган, являющийся не только физическим барьером, защищающим от агрессивных факторов внешней среды, но и уникальной экологической нишей для разнообразных микроорганизмов. Комменсальные бактерии, обитающие на поверхности кожи, играют важную роль в поддержании барьерной функции и иммунного гомеостаза. Основу кожного микробиома составляют преимущественно грамположительные бактерии, включая представителей родов Staphylococcus, Corynebacterium и Cutibacterium. Их взаимоотношения между собой и с организмом хозяина связаны с выработкой низкомолекулярных антимикробных соединений, среди которых ключевую роль играют бактериоцины [10]. Особое внимание в последние годы уделяется лантибиотикам – полициклическим пептидным бактериоцинам, содержащим уникальные аминокислотные остатки, такие как лантионин и β-метиллантионин. Именно эти пептиды наиболее часто синтезируются коагулазонегативными стафилококками [4, 6]. Антибактериальная активность лантибиотиков-стафилококцинов распространяется на различных представителей патогенных бактерий, включая Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes [12]. Благодаря антибактериальному действию, бактериоцины вовлекаются в формирование микробного баланса кожи, предотвращая гиперколонизацию патогенными штаммами и способствуя доминированию комменсальных видов [11]. Бактерии, продуцирующие лантибиотики и другие антимикробные пептиды, обладают не только конкурентными преимуществами в микробиоте кожи, но и способны модулировать врожденный иммунитет хозяина. Установлено, что бактериоцины стафилококков могут влиять на активацию ряда клеточных популяций, регулируя продукцию провоспалительных цитокинов и антимикробных белков [5, 14]. В то же время характер взаимодействия лантибиотиков с клетками иммунной системы находится в самом начале исследований. Изучение механизмов взаимодействия бактериоцинов с клетками врожденного иммунитета и их способности модулировать функциональную активность макрофагов и гранулоцитов, открывает новые возможности для создания иммуномодулирующих и противомикробных средств, которые могут использоваться в терапии инфекционных и воспалительных заболеваний.

Цель работы – исследование влияния стафилококковых бактериоцинов класса лантибиотиков на функциональную активность клеток врожденного иммунитета in vivo и in vitro.

Материалы и методы

В работе исследованы лантибиотики варнерин (APD ID:AP02801), полученный из среды роста бактерий Staphylococcus warneri DSM 16081 [2], хоминин, выделенный из сред роста Staphylococcus hominis ГИСК-284 [1], и низин из Lactococcus lactis (Sigma, США), а также поликатионный синтетический пептид с антибактериальными свойствами – поли-L-агринин гирдохлорид с мол. массой 5000-15000 Да (Sigma, США).

В исследованиях in vivo объектом служили перитонеальные макрофаги белых лабораторных мышей породы Swiss, массой 20-22 г. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986). Мышам внутрибрюшинно вводили исследуемые пептиды в дозах 10, 1, и 0,1 мг/ кг (контрольной группе вводили 0,9%-ный раствор NaCl), через 1 ч мышей выводили из эксперимента методом декапитации под эфирным наркозом и выделяли лейкоциты перитонеальной полости путем промывания брюшной полости раствором Хенкса с 20 ЕД/мл гепарина. После выделения полученную суспензию центрифугировали при 400 g в течение 10 мин. Для оценки поглотительной активности концентрацию клеток доводили до 2 × 106, затем 100 мкл FITC-меченных бактерий Staphylococcus cohnii (109 кл/мл) смешивали со 100 мкл клеток перитонеального смыва (1 × 106), инкубировали в течение 30 мин при 37 °С и промывали 2 раза центрифугированием в буфере DPBS/ЭДТА 0,02% при 4 °С. Регистрацию производили на проточном цитофлуориметре Sino Cyte Flow Cytometer (Китай).

Оценку продукции активных форм кислорода (АФК) производили методом люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ), в лунки 96-луночного планшета вносили 105 клеток в 100 мкл раствора Хенкса. Индуктором и маркером реакции служили опсонизированный зимозан (150 мкг/ мл) и люминол (10-5 М) соответственно. Результат регистрировался на многофункциональном спектрофотометре TECAN (Австрия) в течение часа с интервалом в 5 мин.

В качестве объекта исследований in vitro использовались лейкоциты периферической крови здоровых доноров-добровольцев, которые получали из плазмы путем отстаивания гепаринизированной крови в термостате в течение 2 часов при 37 °С. После чего плазму снимали, центрифугировали при 400 g в течение 20 мин и суспендировали в полной питательной среде (ППС), которую готовили на основе среды 199 с добавлением 10 mM HEPES (Sigma), 2 mM L-глутамина (Sigma), 100 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Варнерин, хоминин, низин и поли-L-аргинин использовали в концентрациях 3 мкг/мл, 0,3 мкг/мл, 0,03 мкг/ мл. Поглотительную активность клеток и детекцию выработки АФК производили методами, описанными выше для in vivo. Популяции моноцитов и гранулоцитов определяли путем оценки фронтального и бокового светорассеивания, в каждом гейте оценивали 50 000 клеток.

Статистическую обработка результатов проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа для парных данных и LSD-критерия для межгруппового сравнения для in vitro и однофакторного дисперсионного анализа для непарных данных и LSD-критерия для межгруппового сравнения для in vivo.

Результаты и обсуждение

Установлено, что in vivo лантибиотики варнерин и хоминин усиливали выработку кислородных радикалов клетками перитонеальной полости в спонтанных и стимулированных пробах во всем исследуемом диапазоне концентраций. В сравнении с ними низин проявил значительно меньшую активность – не влиял на спонтанную и усиливал стимулированную ЛЗХЛ только в одной дозе – 0,1 мг/кг. При исследовании влияния пептидов на фагоцитарную активность in vivo было установлено, что хоминин и низин во всем диапазоне исследуемых доз на процент фагоцитоза не влияли, в то время как варнерин оказывал статистически значимый угнетающий эффект в дозах 1 и 0,1 мг/кг.

В экспериментах in vitro нами было обнаружено, что варнерин и хоминин обладали выраженным модулирующим эффектом по отношению к продукции АФК. Варнерин в высокой концентрации угнетал спонтанную и стимулированную продукцию АФК, а в более низких, напротив, стимулировал. Хоминин спонтанную продукцию АФК во всем диапазоне исследуемых концентраций усиливал, а стимулированную, напротив, угнетал в концентрации 3 мкг/мл. В отличие от варнерина и хоминина, два других бактерицидных пептида – низин и поли-L-аргинин на продукцию АФК лейкоцитами периферической крови влияния не оказывали. Поглотительную способность как моноцитов, так и нейтрофилов in vitro варнерин и хоминин ингибировали, в то время как низин и поли-L-аргинин на фагоцитарную активность выше указанных клеточных популяций не влияли.

Таким образом, бактериальные пептиды, выделенные из сред роста стафилококков, обладают выраженным иммуномодулирующим действием как in vitro, так и in vivo. Показано, что катионные антимикробные пептиды могут активировать клетки врожденного иммунитета благодаря взаимодействию с мембранными рецепторами и влиянию на клеточный метаболизм [9]. В системе in vivo все исследуемые нами пептиды стимулировали продукцию АФК, особенно выражено данный эффект проявлялся у пептидов, выделенных из сред культивирования коагулазонегативных стафилококков – варнерина и хоминина. Лантибиотик низин, получаемый из сред роста молочнокислых бактерий L. lactis обладал менее выраженным эффектом на микробицидный потенциал. На поглотительную активность клеток перитонеального смыва in vivo значимое действие оказывал только варнерин, которое выражалось в снижении фагоцитарной активности.

В системе in vitro выраженное угнетающее действие на поглотительную активность макрофагов и гранулоцитов было зарегистрировано как у варнерина, так и у хоминина, в то же время направленность действия этих пептидов на микробицидный потенциал зависела от концентрации пептида и присутствия активирующего сигнала. Такая полифункциональность является одной из особенностей пептидов данной группы. Так, например, продуцируемый бактериями Streptococcus salivarius лантибиотик сальвариоцин разнонаправлено регулирует фагоцитоз, продукцию кислородных радикалов и провоспалительных цитокинов [3, 8]. Известно также о продукции бактериями Staphylococcus epidermidis фенолорастворимых модулинов, регулирующих функции иммунных клеток кожи [5, 13]. Угнетение фагоцитоза является свидетельством особой функции антимикробных пептидов, защищающей стафилококков-продуцентов от клеток врожденного иммунитета и способствующей повышению выживаемости микробных популяций в организме хозяина.

В то же время у низина и поли-L-аргинина, которые, обладая выраженной противомикробной активностью модулирующих эффектов в отношении клеток врожденного иммунитета in vitro, выявить не удалось. Это может быть связано с тем, что низин – продукт синтеза молочнокислых бактерий, проявляет преимущественно прямую антимикробную активность и модулировать функции клеток иммунной системы может только в определенных условиях [7, 15].

Выводы

1. Антимикробные пептиды способны одновременно подавлять рост конкурентной микрофлоры и модулировать врожденный иммуннитет.
2. Обнаруженные различия в действиях отдельных пептидов in vitro и in vivo позволяют предположить, что иммуномодулирующее действие пептидов может опосредоваться различными молекулярными механизмами и клеточными мишенями.

Об авторах

Сергей Владимирович Гейн

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук; ФГАОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: hein73@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0799-3397

д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии развития микроорганизмов, профессор кафедры микробиологии и иммунологии

Россия, г. Пермь; г. Пермь

Татьяна Вячеславовна Полюдова

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Email: poludova76@mail.ru

к.б.н., заведующая лабораторией биохимии развития микроорганизмов

Россия, г. Пермь

Матвей Викторович Ибатуллин

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук; ФГАОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Email: manovvi@yandex.ru

магистрант кафедры микробиологии и иммунологии, инженер лаборатории биохимии развития микроорганизмов

Россия, г. Пермь; г. Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы