PROTEIN A-ANTIGEN CONJUGATES ENHANCE PRODUCTION OF SPECIFIC ANTIBODIES FOLLOWING INTRANASAL ADMINISTRATION

Ekaterina A. Volosnikova; Волосникова Екатерина Александровна; N. V. Volkova; Волкова Н. В.; S. I. Gayvoronskiy; Гайворонский С. И.; O. V. Simakova; Симакова О. В.; T. I. Esina; Есина Т. И.; A. A. Rar; Рар А. А.; D. N. Shcherbakov; Щербаков Д. Н.

doi:10.46235/1028-7221-17148-PAA

КОНЪЮГАТЫ БЕЛКА А С АНТИГЕНОМ СПОСОБНЫ УСИЛИВАТЬ ВЫРАБОТКУ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ

Авторы: Волосникова Е.А.¹, Волкова Н.В.¹, Гайворонский С.И.¹, Симакова О.В.¹, Есина Т.И.¹, Рар А.А.¹, Щербаков Д.Н.¹
Учреждения:
1. ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор”» Роспотребнадзора
Выпуск: Том 28, № 3 (2025)
Страницы: 567-572
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Дата подачи: 28.03.2025
Дата принятия к публикации: 25.05.2025
Дата публикации: 07.09.2025
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/17148
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-17148-PAA
ID: 17148

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Резюме

Цель. Изучение иммуногенных свойств конъюгатов белка А с рецептор-связывающего домена (RBD) спайкового белка SARS-CoV-2 (вариант B.1.617.2, Delta) и их способности индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ при интраназальном введении.

Материалы и методы. Конъюгаты рекомбинантного RBD (SARS-CoV-2, вариант Delta) с белком А Staphylococcus aureus получали с использованием EDC или Sulfo-SMCC (1:1 моль) с последующей очисткой гель-фильтрацией. Иммунизацию проводили на 80 мышах Balb/c (6 недель), разделенных на группы по 10 особей. Животным опытных групп двукратно с интервалом 14 дней вводили интраназально 20 мкл конъюгата (50 мкг RBD), контрольным группам - RBD внутримышечно или физраствор. Кровь забирали на 10-й день после бустинга. Титр специфических IgG определяли ИФА с использованием RBD в качестве антигена. Статистическую значимость оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни (GraphPad Prism 8.0, p<0.05).

Результаты. Интраназальное введение конъюгатов RBD с белком А (Con-S и Con-E) индуцировало высокие титры специфических IgG (до 10⁵), сопоставимые с внутримышечным введением RBD. Оба конъюгата показали статистически значимое усиление иммунного ответа по сравнению с интраназальным введением свободного RBD (p≤0.05). При этом наблюдалась гетерогенность ответа среди животных: часть мышей демонстрировала слабый иммунный ответ, что может быть связано с особенностями интраназального введения.

Выводы. Конъюгаты RBD с белком А Staphylococcus aureus при интраназальном введении вызывают выраженный IgG-ответ, сравнимый с внутримышечной иммунизацией, демонстрируя адъювантные свойства белка А. Оба метода конъюгирования (Sulfo-SMCC и EDC) одинаково эффективны. Несмотря на вариабельность ответа, связанную с особенностями мукозального введения, результаты подтверждают перспективность использования белка А в разработке интраназальных вакцин против SARS-CoV-2.

Ключевые слова

мукозальные вакцины, Белок А Staphylococcus aureus, SARS-CoV-2, интраназальная иммунизация, адъюванты, гуморальный иммунный ответ.

Полный текст

Введение

Современная вакцинология активно развивается в направлении поиска новых способов доставки антигенов и усиления иммунного ответа, особенно на слизистых оболочках, которые являются первым барьером на пути многих патогенов [7]. Интраназальное и пероральное введение вакцин представляет особый интерес, поскольку оно позволяет стимулировать как местный мукозальный, так и системный иммунный ответ, что критически важно для защиты от респираторных и других инфекций, передающихся через слизистые оболочки [5].

Одним из ключевых факторов успеха мукозальных вакцин является использование эффективных адъювантов – веществ, которые усиливают иммунный ответ на вводимый антиген [7]. Можно выделить несколько групп подобных адъювантов. Бактериальные токсины и их производные, агонисты паттерн-распознающих рецепторов, наночастицы и липидные системы доставки, цитокины и мукоадгезивные системы [3, 4, 7]. Особый интерес представляют белковые мукозальные адъюванты, наиболее изученным из которых является холерный токсин [5, 12]. Субъединица В холерного токсина взаимодействует с рецептором GM1, который экспрессируется на макрофагах, дендритных и В-клетках, вызывая индукцию иммунного ответа. Показано, что рекомбинантный аналог B субъединицы холерного токсина стимулирует Т-хелперные клетки Th1 и Th2-типа.

Холерный токсин, являясь одним из самых мощных мукозальных адъювантов [1], может также выступать в роли системы доставки антигена и способен формировать эффективный иммунный ответ в месте внедрения большинства известных патогенов. Описаны конструкции, содержащие последовательность В-субъединицы холерного токсина в единой рамке считывания с Fc-фрагментом IgG [6]. Описан и ряд других адъювантов на основе бактериальных токсинов [7].

В данном исследовании мы сосредоточились на изучении способности конъюгатов рекомбинантного токсина Staphylococcus aureus с белком антигеном стимулировать выработку специфических антител при интраназальном введении. Актуальность этой работы обусловлена необходимостью разработки новых адъювантов, которые могли бы обеспечить длительный и устойчивый иммунный ответ на слизистых оболочках, что особенно важно для профилактики инфекционных заболеваний, таких как грипп, COVID-19 и других респираторных инфекций [11].

Целью настоящего исследования стало изучение иммуногенных свойств конъюгатов белка А с рецептор-связывающим доменом (RBD) спайкового белка SARS-CoV-2 (вариант B.1.617.2, Delta) и их способности индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ при интраназальном введении.

Материалы и методы

Метод получения конъюгатов

Получение конъюгатов рекомбинантного белка А и рекомбинантного RBD (вариант B.1.617.2 (Delta)) проводили с использованием 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлорида (EDC) и сульфосукцинмидил-4-[N-малеимидометил]-циклогексан-1-карбоксилата (Sulfo-SCMM). При проведении реакции конъюгирования к субстанции белка RBD добавляли сшивающий агент EDC либо Sulfo-SCMM в соотношении 1:1 моль, инкубировали смесь в течение 2 часов при 2-8 °С и добавляли субстанцию белка А, инкубировали смесь в течение 2 часов при 2-8 °С. В случае конъюгирования с помощью Sulfo-SCMM амидные группы восстанавливали добавлением боргидрида натрия в соотношении 1:10 белок RBD:боргидрид натрия. Непрореагировавшие компоненты удаляли с помощью гель-фильтрации на сефакриле S-200.

Определение концентрации белка в конъюгатах

Определение проводили методом Лоури без предварительного осаждения белка по ГФ XIV, том 1, ОФС.1.2.3.0012.15 «Определение белка» (метод 2, колориметрический).

Иммунизация животных

Исследование проведено на 80 самках мышей линии Balb/c возрастом 6 недель, с массой тела 18-22 г, полученных из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (р. п. Кольцово Новосибирской обл.). Животные были распределены случайным образом на группы по 10 особей в каждой.

Для индукции иммунного ответа мышам опытных групп вводили интраназально двукратно с интервалом 14 суток 1 дозу (20 мкл) конъюгата белка RBD c белком А, в которой содержится отработанная ранее доза белка RBD (50 мкг) в суммарном объеме 20 мкл/мышь. Мыши группы сравнения получали инъекции RBD внутримышечно в тех же дозах в объеме 200 мкл/мышь по аналогичной схеме. Мышам контрольной группы вводили физиологический раствор интраназально в объеме 20 мкл.

Забор крови у мышей проводили на 10-й день после второй иммунизации пастеровской пипеткой из ретроорбитального синуса в объеме 0,5 мл. Процедура выполнялась на анестезированных с помощью углекислого газа животных [2].

Для формирования сгустка и отделения сыворотки кровь оставляли при комнатной температуре на 15 минут, затем края сгустка крови аккуратно, не разрушая клетки, обводили чистой иглой для открепления от стенок пробирки и центрифугировали в течение 15 мин при 3 тыс. об/мин и температуре 4-6 °С 1 час, затем выдерживали в холодильнике при (4±2) °С в течение двух часов. Центрифугирование проводили на центрифуге 5810R при температуре (6±2) °С со скоростью 1800 об/мин в течение 15 минут. Полученную сыворотку аккуратно, не захватывая форменные элементы, отбирали пипеткой и переливали в промаркированные микроцентрифужные пробирки. Сыворотки крови хранили при температуре (6±2) °С не более 7 дней. Для более длительного хранения сыворотки замораживали при температуре минус 20 °С. После забора крови мышей подвергали эвтаназии путем цервикальной дислокации.

Анализ титров специфических антител

Титры специфичных антител в сыворотках крови определяли методом иммуноферментного анализа. В качестве антигена использовали рекомбинантный рецептор-связывающий домен (RBD) спайкового белка SARS-CoV-2 (вариант B.1.617.2 (Delta)). Сорбцию антигенов (200 нг/ лунку) проводили в буфере 0,1 М NaHCO₃. Для выявления антител использовали конъюгат антимышиных антител с пероксидазой хрена в рабочем разведении 1:2000 (Sigma-Aldrich, США). Для регистрации уровня оптической плотности после добавления субстрата и остановки реакции использовали мультимодальный ридер Thermo Scientific Varioskan LUX при длине волны 450 нм. Титр определяли по значению максимального разведения, при котором сигнал оптической плотности превышал значение оптической плотности лунок с отрицательным контролем более чем в три раза.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8.0, при этом p < 0,05 считали показателем статистической значимости. Статистическую значимость различий среди разных групп животных определяли с помощью двустороннего непараметрического U-критерия Манна–Уитни с 95% доверительным интервалом или критерия Краскела–Уоллиса (для более чем двух групп).

Результаты и обсуждение

Мукозальные вакцины являются привлекательным способом формирования специфического иммунитета, потому что способны обеспечить защиту на уровне входных ворот инфекции. Особенно это актуально для инфекций, передающихся воздушно-капельным путем, поэтому проверку возможности использования рекомбинантного белка А Staphylococcus aureus в качестве мукозального адъюванта было решено провести на модели SARS-CoV-2. В качестве антигена был выбран RBD спайкового белка, т. к. он является основной мишенью вирус-нейтрализующих антител, и формирование иммунитета против него способно обеспечить защиту организма от заражения [9, 13].

Рекомбинантные белки RBD (вариант B.1.617.2 (Delta)) и Z домен белка А Staphylococcus aureus, использованные в работе для синтеза конъюгатов, были получены в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. С использованием двух сшивающих агентов Sulfo-SMCC и EDC было получено два препарата Con-S и Con-E соответственно. Конъюгат был рассчитан таким образом, чтобы на одну молекулу RBD приходилась одна молекула рекомбинантного белка А. При помощи гель-фильтрации были отобраны стабильные комплексы, которые выходили отдельным пиком и составляли до 90% от всех пиков. Это свидетельствует о том, что выбранный метод конъюгации эффективен и позволяет получать высокий выход конъюгата в реакции синтеза.

Изучение адъювантных свойств проводили на модели мышей Balb/c. Животным опытных групп интраназально вводили препараты в дозе 50 мкг (RBD), двукратно с интервалом 14 суток. Мыши группы сравнения получали инъекции RBD внутримышечно в тех же дозах с аналогичным интервалом. Мышам контрольной группы вводили физиологический раствор интраназально.

Интраназальная иммунизация мышей конъюгатами рекомбинантного белка А и RBD привела к индукции высоких титров специфических IgG. Значение среднего реципрокного титра антител групп Con-S и Con-E достоверно не отличалось и достигло 10⁵ (рис. 1). Сходные значения были получены для сывороток мышей, иммунизированных RBD внутримышечно. В то же время они достоверно отличались от значений группы мышей, иммунизированных RBD интраназально, без использования адъюванта по сравнению с группой, получавшей свободный RBD (рис. 1). Полученные данные позволяют предположить, что белок А, связываясь с Fc-фрагментами иммуноглобулинов, может усиливать презентацию антигена иммунным клеткам, что способствует более эффективной активации гуморального иммунного ответа. Это согласуется с современными представлениями о роли Fc-зависимых механизмов в модуляции иммунного ответа, особенно в контексте использования адъювантов для усиления иммуногенности антигенов [10].

Рисунок 1. Реципрокные титры специфических антител у мышей Balb/c иммунизированных конъюгатами RBD. Примечание. RBD в/м – внутримышечное введение антигена; RBD – интраназальное введение антигена; Con-S – интраназальное введение конъюгата, полученного при помощи Sulfo-SMCC; Con-E – интраназальное введение конъюгата, полученного при помощи EDC; физр-р – интраназальное введение физиологического раствора. Для оценки значимости межгрупповых различий применяли непараметрический U-критерий Манна–Уитни с критическим уровнем статистической значимости (р), равным 0,05. * – статистически значимые отличия по отношению к группе (без адъюванта), р ≤ 0,05.

Необходимо обратить внимание, что иммунный ответ для групп Con-S и Con-E был в значительной степени гетерогенным, часть животных отвечала слабо или не ответила совсем, в то время как в группе внутримышечного введения у всех животных наблюдали индукцию специфических антител, а реципрокный титр антител в сыворотках лежал в диапазоне 10⁴-10⁵. Этот результат, по всей видимости, связан с тем, что интраназальное введение и использование мышей как модели сопряжено со сложностью контроля полноты введения препарата. В то же время полученный результат указывает на достоверную способность конъюгатов белка А стимулировать выработку специфического иммунитета.

Наше исследование показало принципиальную возможность использования белка А Staphylococcus aureus для получения вакцинных конструкций. На следующем этапе планируется изучение местного иммунитета, в первую очередь уровня IgA на слизистых оболочках и клеточного иммунного ответа.

Выводы

Интраназальное введение конъюгатов рекомбинантного белка А Staphylococcus aureus с RBD-доменом спайкового белка SARS-CoV-2 (вариант Delta) индуцировало высокие титры специфических IgG в сыворотке крови мышей, сопоставимые с внутримышечным введением свободного RBD. Оба метода конъюгирования (с использованием Sulfo-SMCC и EDC) показали схожую эффективность, что подтверждает стабильность и функциональность полученных комплексов. Конъюгаты достоверно усиливали гуморальный иммунный ответ по сравнению с интраназальным введением RBD без адъюванта, что свидетельствует о способности белка А выступать в роли мукозального адъюванта. Наблюдалась значительная вариабельность уровня антител среди животных в группах интраназального введения, что может быть связано с техническими сложностями контроля дозировки при мукозальной иммунизации или индивидуальными особенностями проникновения антигена через слизистый барьер.

Об авторах

Екатерина Александровна Волосникова

ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор”» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: volosnikova_ea@vector.nsc.ru

к.б.н., ведущий научный сотрудник, заведующая отделом разработки технологий и пилотного производства биопрепаратов