Регуляция синтетическим пептидом ZP2 антицитокиновой активности микроорганизмов, выделенных при послеоперационных осложнениях

Полный текст

Введение

В настоящее время одними из наиболее перспективных препаратов являются синтетические пептиды, обладающие широкой биологической активностью. Такие препараты получают из человеческих активных молекул пептидной природы – например синтетический пептид активного центра гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) – ZP2. Пептид ZP2 обладает иммуностимулирующим и репарационным действием, характеризуется антимикробным влиянием на музейные и клинические изоляты грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов [2, 3, 4]. Синтетический пептид ZP2, обладающий широким спектром иммунобиологических эффектов, является основой косметического средства «Ацеграм», которое используется для местного применения в терапевтической и хирургической практике [5].

Установлено, что чаще всего инфекционно-воспалительные процессы ассоциированы с микроорганизмами, обладающими набором факторов персистенции [6, 7]. Так, в настоящее время в научной литературе широко изучается способность микроорганизмов инактивировать про- и противовоспалительные цитокины. Показано, что антицитокиновая активность (АЦА) встречается у микроорганизмов, выделенных при различных инфекционно-воспалительных процессах [6, 7, 8].

Ранее было экспериментально установлено, что синтетический пептид ZP2 способен влиять на выраженность АЦА у клинических изолятов грамположительных и грамотрицательных бактерий разной видовой принадлежности [3, 10] и грибов рода Candida [9]. Однако факт влияния ZP2 на АЦА грамотрицательных микроорганизмов, выделенных от пациентов с послеоперационными осложнениями, требует более детального изучения.

Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка влияния синтетического пептида ZP2 – аналога активного центра ГМ-КСФ на АЦА грамотрицательных бактерий разных видов, выделенных при послеоперационных осложнениях.

Материалы и методы

В эксперименты in vitro были включены клинические изоляты грамотрицательных бактерий разных видов: Escherichia coli (n = 6), Klebsiella pneumoniae (n = 6), Citrobacter braakii (n = 6), C. freundii (n = 6), Stenotrophamonas maltophilia (n = 6), Pseudomonas aeruginosa (n = 6), P. putida (n = 6), выделенные при послеоперационных осложнениях у пациентов с хирургической патологией.

Выделение чистых культур микроорганизмов проводили общепринятым бактериологическим методом, видовую идентификацию осуществляли по прямому белковому профилированию с помощью масс-спектрометра MALDI TOF MS серии Microflex LT (Bruker Daltonics, Германия) и программного обеспечения MaldiBioTyper 3,0.

Для изучения влияния синтетического пептида ZP2 на АЦА клинических изолятов грамотрицательных бактерий проводили культивирование 1 мл взвеси бактерий в физиологическом растворе с 1 мл раствора пептида ZP2 с концентрацией 0,1 мкг/мл в 2 мл МПБ при 37 °С в течение 24 ч. В качестве контроля использовали пробы без добавления пептида ZP2. Затем контрольные и опытные пробы центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин, супернатант сливали, добавляли к осадку 2 мл МПБ и ресуспензировали.

АЦА в отношении IL-8, IL-4, TNFα и IL-1Rа определяли ИФА по известной методике в оригинальной модификации с использованием наборов ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) [1]. Для этого в центрифужные пробирки вносили в соотношении 1:1 взвесь бактерий и растворы соответствующих цитокинов, пробы инкубировали в течение 2 часов при 37 °С. После инкубации реакцию останавливали на холоде, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин (+4 °С) и отбирали супернатанты. В качестве контроля использовали растворы цитокинов в физиологическом растворе. Конечная концентрация цитокинов в опытных и контрольных пробах составляла для IL-8 – 62,5 пг/мл, IL-4 – 28,6 пг/мл, TNFα – 41,6 пг/мл, IL-1Rа – 416,6 пг/мл.

Результаты учитывали на фотометре StatFax 2100 (США) при длине волны 450 нм. Для оценки АЦА клинических изолятов грамотрицательных бактерий, вычисляли долю инактивации цитокинов в опыте относительно контроля и выражали в пг/мл.

Полученные данные обработаны с помощью вариационной статистики.

Результаты и обсуждение

Полученные данные свидетельствовали, о том, что штаммы бактерий, выделенные при послеоперационных осложнениях, способны секретировать соединения, инактивирующие IL-8, IL- 4, TNFα и IL-1Rа (рис. 1). При этом наблюдалась межвидовая вариабельность как по наличию и частоте встречаемости, так и по выраженности указанного признака.

 

Рисунок 1. Влияние пептида ZP2 на антицитокиновую активность клинических изолятов

Примечание. * – p < 0,01.

 

Так, показано, что 33,3% изолятов E. coli и C. braakii; 50% штаммов P. aeruginosa и 66,7% штаммов S. maltophilia были способны инактивировать IL-8 со средним значением выраженности признака 53,3±2,8 пг/мл. Минимальное значение АЦА было характерно для изолятов P. aeruginosa (38,7±2,8 пг/мл), а максимальное – для штаммов E. coli (62,0±1,4 пг/мл).

Под действием синтетического пептида ZP2 количество штаммов E. coli и P. aeruginosa, обладающих АЦА в отношении IL-8, не изменялось, а выраженность признака оставалась на прежнем уровне, что указывало на индифферентность данных бактерий к влиянию указанного пептида. Напротив, 66,7% штаммов S. maltophilia, проявляющие АЦА к IL-8, под влиянием синтетического пептида ZP2 теряли такую способность. Число штаммов C. braakii, характеризующихся наличием АЦА в отношении IL-8, под влиянием ZP2 увеличивалось вдвое – с 33,3% до 66,7%, хотя выраженность признака значимо не изменялась.

По 33,3% штаммов E. coli и P. putida и 66,7% изолятов K. pneumonia обладали АЦА к IL- 1Rа, среднее значение признака составило 347,3±7,6 пг/мл. Действие пептида ZP2 приводило к ингибированию АЦА в отношении IL-1Rа у всех штаммов клебсиелл и псевдомонад, но не изменяло распространенность и выраженность признака среди эшерихий.

Показано, что 33,3% штаммов E. coli, 66,7% изолятов K. pneumonia, S. maltophilia и C. freundii и все штаммы P. aeruginosa, P. putida и C. braakii проявляли АЦА в отношении IL-4. Среднее значение признака составило 26,5±2,2 пг/мл, при этом разброс значений был не значительным – минимум был характерен для штаммов C. freundii (24,8±2,5 пг/мл), максимум – для изолятов P. putida (30,0±2,4 пг/мл). После влияния ZP2 количество штаммов P. aeruginosa, P. putida, C. braakii и C. freundii, способных инактивировать IL-4 не изменилось, а количество изолятов E. coli, K. pneumonia и S. maltophilia с данной активностью увеличилось до 100%. При этом достоверных изменений выраженности АЦА в отношении IL-4 не было выявлено, за исключением штаммов P. putida, выраженность признака у которых снизилась в 1,6 (p < 0,01).

Треть штаммов P. putida, C. braakii, C. freundii и S. maltophilia; 66,7% изолятов E. coli и 100% P. aeruginosa обладали АЦА в отношении TNFα. Среднее значение признака составило 34,9±3,4 пг/мл. Минимальное значение АЦА в отношении TNFα отмечалось у штаммов E. coli (25,4±3,4 пг/ мл), максимальное – у изолятов P. putida (40,9±3,4 пг/мл). В результате действия пептида ZP2 число штаммов E. coli, P. aeruginosa и C. braakii с данной способностью снижалось до 0. С другой стороны, пептид ZP2 увеличивал количество изолятов S. maltophilia и P. putida, способных инактивировать TNFα до 66,7% и 100% соответственно, причем выраженность этого признака достоверно уменьшалась (в 9,8 и 1,9 раза, p < 0,01). Среди штаммов C. freundii под влиянием пептида ZP2 число изолятов с АЦА в отношении TNFα не изменялось, тогда как выраженность данного признака снижалась в 1,6 раза (p < 0,01).

Таким образом, синтетический пептид ZP2 в зависимости от рода/вида грамотрицательных бактерий по-разному влиял на проявление ими АЦА к изученным цитокинам (IL-8, IL-1Rа, IL- 4, TNFα), что указывало на его родо- и видоспецифические эффекты в отношении способности микроорганизмов инактивировать указанные цитокины.

В результате проведенных исследований установлено, что все большинство клинических изолятов грамотрицательных бактерий разной видовой принадлежности (66,7-100%) за исключением штаммов E. coli (доля которых составила 33,3%) были способны инактивировать противовоспалительный цитокин IL-4, тогда как в отношении IL-1Rа АЦА обнаруживалась среди энтеробактерий только у штаммов E. coli и K. pneumoniae, а из группы неферментирующих бактерий – у P. putida.

Что касается провоспалительных цитокинов, то к инактивации TNFα были способны все изученные микроорганизмы, кроме изолятов K. pneumoniae, в отличие от АЦА в отношении IL- 1Rа, которой обладали только штаммы E. coli, K. pneumoniae и P. putida.

Таким образом, в настоящем исследовании дана сравнительная оценка способности клинических изолятов грамотрицательных бактерий, выделенных при послеоперационных осложнениях, инактивировать некоторые про- и противовоспалительные цитокины и показана ее зависимость от родовой/видовой принадлежности микроорганизмов.

В то же время результаты экспериментов in vitro указывали на то, что синтетический пептид ZP2 проявлял преимущественно ингибирующее действие на частоту встречаемости и выраженность у изученных клинических изолятов грамотрицательных бактерий АЦА в отношении про- и противовоспалительных цитокинов (IL- 4, IL-8, IL-1Rа, TNFα). При этом выраженность АЦА в отношении IL-8 не изменялась (E. coli, P. aeruginosa и C. braakii) или критично уменьшалась (S. maltophilia); АЦА в отношении IL-1Rа не изменялась (E. coli) и исчезала (K. pneumoniae и P. putida); выраженность АЦА в отношении IL-4 у всех изученных микроорганизмов существенно не изменялась.

Эти данные отражают модифицирующий потенциал синтетического пептида ZP2, который способен изменять как распространенность, так и выраженность изученного признака.

Ранее аналогичные эффекты были зарегистрированы на примерах изучения влияния синтетического пептида ZP2 на АЦА различных микроорганизмов: бактерий рода Enterococcus, выделенных из секрета предстательной железы мужчин с признаками урогенитальной инфекции [10]; грибов рода Candida, выделенных из отделяемого влагалища условно-здоровых беременных [9].

В совокупности эти данные свидетельствуют о возможности изменения концентрации про- и противовоспалительных цитокинов в среде культивирования микроорганизмов при действии на них синтетического пептида ZP2, что не исключает подобного действия данного пептида в условиях in vivo.

Таким образом, выявленные в экспериментах in vitro модифицирующие эффекты синтетического пептида ZP2, входящего в состав косметического средства Ацеграм, в отношении способности клинических изолятов инактивировать отдельные про- и противовоспалительные цитокины расширяют спектр потенциального клинического применения указанного препарата.

Выводы

1. Грамотрицательные бактерии, выделенные при послеоперационных осложнениях, способны секретировать соединения, инактивирующие цитокины IL-4, IL-8, IL-1Rа, TNFα.
2. Синтетический пептид ZP2 в субингибиторных концентрациях оказывает модифицирующее действие на проявление изученными микроорганизмами АЦА.

Об авторах

О. А. Пашинина

ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: olga25mikro@mail.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Россия, Оренбург

Т. М. Пашкова

ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Email: olga25mikro@mail.ru

д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Россия, Оренбург

В. А. Гриценко

ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Email: olga25mikro@mail.ru

д.м.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Россия, Оренбург

Список литературы

Дополнительные файлы