Эффект совместного влияния метотрексата с фитоэкстрактами клевера и цикория на продукцию провоспалительных цитокинов in vitro

Полный текст

Введение

В последние годы расширяется диапазон заболеваний, при лечении которых метотрексат (МТХ) используется как препарат первой линии и/или как основное и дополнительное лекарственное средство. Первоначально разработанный как противоопухолевый препарат, МТХ в настоящее время благодаря его противовоспалительному, антиметаболитному, иммуномодулирующему действию применяется при лечении ревматоидного артрита, ювенильного идиопатического артрита, псориаза, при воспалительных заболеваниях кишечника, рассеянном склерозе, васкулите, системной красной волчанке и многих других заболеваниях соединительной ткани и кожи [7]. Однако одним из факторов, ограничивающих применение МТХ, является его токсическое действие, в том числе способность индуцировать окислительный стресс, гепатоксичность, нефротоксичность, иммуносупрессию и др. [6, 12].

Одним из аспектов ограничения токсичности подобных препаратов является использование средств растительного происхождения, являющихся доступными, безопасными и обладающими высокой биологической активностью, включая способность потенцировать эффект лечебных препаратов. Клевер луговой (Trifolium pratense L.) и цикорий обыкновенный (Cichorium intybus L.) и экстракты, полученные из этих растений, содержат большой комплекс биологически активных веществ (БАВ) полифенольной природы, обладающих антиоксидантными, противовоспалительными, иммунокорригирующими и др. свойствами [1, 2, 5]. Вместе с тем разрозненный характер сведений о механизмах противовоспалительной активности индивидуальных фитоэкстрактов, связанный с особенностями их выделения, а также очистки и стандартизации фитопрепаратов, ограничивает возможности целенаправленного поиска БАВ с противовоспалительной активностью в использующихся и перспективных лекарственных растениях. Следует также отметить, что вопрос о защитном влиянии экстрактов цикория и клевера в отношении иммунодепрессивного влияния МТХ остается открытым. Целью работы явилась оценка влияния фитоэкстрактов клевера и цикория на секрецию провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-17 мононуклеарными клетками периферической крови человека при МТХ-индуцированной иммуносупрессии.

Материалы и методы

Объектами исследования послужили сухие экстракты из травы клевера лугового и травы цикория обыкновенного, полученные методом перколяции [3, 4]. Периферические мононуклеарные клетки (ПМК) выделяли из гепаринизированной крови здоровых доноров методом градиентного центрифугирования (400 g) в градиенте плотности фиколл-верографин (Pharmacia, Швеция) плотностью 1,077 г/см³. Базовая (нестимулированная) продукция провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-17 исследовалась в культуре мононуклеаров, сокультивируемых с водными растворами фитоэкстрактов (2,0 мг/мл) с добавлением МТХ (Sandoz, Словения; лекарственная форма – раствор для инъекций) в концентрации 10,0 мкг/мл (опыт 1) и без МТХ (опыт 2). Для оценки индуцированной продукции исследуемых провоспалительных цитокинов к лимфоцитам добавляли конканавалин A (Кон А) (НПП «ПанЭко», Россия) в концентрации 20,0 мкг/мл. В качестве контроля были использованы пробы, где к периферическим мононуклеарам добавлялась только культуральная среда (контроль 1) или культуральная среда с Кон А (контроль 2). После 24-часовой инкубации клеток (2 × 10⁶) при 37,0 °С в атмосфере 5,0% СО₂ в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10,0% фетальной сыворотки (НПП «ПанЭко», Россия) и 80,0 мкг/мл гентамицина собирали культуральную жидкость и замораживали (-20 °С). Исследования проводили в 3 дублях для каждого исследуемого образца. Уровень спонтанной и индуцированной продукции цитокинов после сокультивирования лимфоцитов с водными растворами фитоэкстрактов исследовали методом ИФА (ООО «Цитокин», Россия) с регистрацией результатов на фотометре Multiskan (Labsystems, Финляндия), длина волны 492 нм. Статистическую обработку полученных данных проводили средствами пакета Statistica 10 (StatSoft, США) с оценкой различий между величинами по критерию Манна–Уитни (р < 0,05).

Результаты и обсуждение

Оценка иммунорегуляторной активности сухих экстрактов травы клевера и цикория на модели мононуклеаров периферической крови человека показала, что фитоэкстракты подавляли продукцию провоспалительных цитокинов в системе in vitro как спонтанную (TNFα, IL-6), так и индуцированную (TNFα, IL-6 и IL-17). Следует отметить, что выраженность ингибирующего эффекта фитоэкстрактов не уступала, а в отношении отдельных цитокинов (TNFα и IL-17) превосходила фитопрепарат «Иммунал». Так, добавление в среду культивирования ПМК фитоэкстракта клевера и цикория сопровождалось снижением базовой и индуцированной продукции ключевого провоспалительного цитокина TNFα в 2 и 4 раза относительно контролей лимфоцитов (136,5 ± 13,8 пг/мл и 239,9 ± 24,2 пг/ мл соответственно, р < 0,05). Напротив, препарат «Иммунал» оказывал стимулирующее влияние на базовую продукцию TNFα (191,2 ± 14,5 пг/мл), не изменяя индуцированную секрецию.

В отношении IL-6 эффекты исследуемых образцов были однонаправленными и характеризовались подавлением базовой и индуцированной продукции цитокина лимфоцитами, но отличались по уровню выраженности влияния. Добавление к периферическим мононуклеарам «Иммунала» приводило к незначительному снижению уровня IL-6 (на 18,0-30,5%) относительно контролей (433,7 ± 16,0 пг/мл и 469,0 ± 18,5 пг/мл соответственно, р < 0,05). Внесение в культуральную среду экстракта клевера сопровождалось уменьшением продукции IL-6 в 2 раза у нестимулированных лимфоцитов и в 3 раза у индуцированных клеток. Наиболее сильное ингибирующее влияние на продукцию лимфоцитами цитокина оказывал фитоэкстракт цикория, снижающий уровень IL-6 в 20 раз, независимо от присутствия в среде Кон А.

Содержание другого провоспалительного цитокина IL-17 в культуральной среде нестимулированных лимфоцитов в присутствии обоих фитоэкстрактов и «Иммунала» не отличалось от уровня базовой секреции данного цитокина и соответствовало значениям контроля (38,3 ± 4,5 пг/ мл). Вместе с тем внесение исследуемых образцов в среду индуцированных Кон А лимфоцитов приводило к двухкратному снижению продукции IL-17 под влиянием «Иммунала» и к двадцатикратному – в присутствии обоих фитоэкстрактов по сравнению с контролем 1 (631,7 ± 58,3 пг/мл, р < 0,05).

Анализ сочетанного влияния фитоэкстрактов и «Иммунала» совместно с МТХ позволил установить их ингибирующий эффект в отношении продукции TNFα, IL-6 и IL-17 лимфоцитами, при этом более выраженным потенцирующим действием обладал образец из сухой травы цикория. В предварительных исследованиях было установлено отсутствие влияния самого МТХ в концентрации 10,0 мкг/мл в отношении базовой и стимулированной продукции TNFα и IL-17. Вместе с тем МТХ способствовал снижению уровня IL-6 до 358,0 ± 29,5 пг/мл в среде с не стимулированными ПМК и до 367,0 ± 32,0 пг/мл – с лимфоцитами, индуцированными Кон А. При внесении в культуральную среду «Иммунала» с МТХ отмечалась синергидность их противовоспалительного эффекта, но только для продукции TNFα и IL-17. В отношении TNFα установлено появление ингибирующего воздействия обоих образцов, для IL-17 – усиление эффекта на два порядка в сравнении с непосредственным влиянием «Иммунала» (с 631,7 ± 58,3 пг/мл до 250,1 ± 21,4 пг/мл и 130,7 ± 18,9 пг/мл соответственно, р < 0,05). В отношении базовой и стимулированной продукции IL-6 сочетанный противовоспалительный эффект не отмечался и соответствовал влиянию препаратов в отдельности.

В сочетании с фитоэкстрактом клевера на порядок усиливался противовоспалительный эффект МТХ в отношении базовой и стимулированной продукции TNFα и IL-6 (р < 0,05). Для IL-17 ингибирующий эффект соответствовал влиянию отдельно взятому образцу клевера на продукцию индуцированных лимфоцитов. Добавление к периферическим мононуклеарам цитостатика MTX с фитоэкстрактом цикория сопровождалось двухкратным (в сравнении с контролем лимфоцитов – 77,4 ± 11,0 пг/мл и 81,5 ± 6,5 пг/мл, р < 0,05) снижением продукции TNFα и многократным (в 19-20 раз в сравнении с контролем, р < 0,05) подавлением продукции IL-6 и IL-17 как у нестимулированных лимфоцитов, так и индуцированных Кон А.

Таким образом, было установлено ингибирующее влияние фитоэкстрактов клевера и цикория, а также их сочетаний с МТХ на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови человека – TNFα, IL-6, IL-17. Показано потенцирующее влияние фитоэкстрактов на усиление ингибирующего эффекта цитостатика МТХ в отношении продукции лимфоцитами IL-6 и появление противоспалительного влияния в отношении TNFα и IL-17. Наиболее выраженным иммунорегуляторным и потенцирующим эффектом в отношении противовоспалительного воздействия МТХ обладал фитоэкстракт цикория, однако оба экстракта превосходили влияние известного фитопрепарата на основе Echinacea purpurea L.

Обсуждая полученные результаты, необходимо отметить, что в ранее проведенных работах было установлено, что исследуемое сырье Trifolium pratense L. и Cichorium intybus L. и полученные из него экстракты содержат БАВ полифенольной природы – флавоноиды, гидроксикоричные кислоты и фенольные кислоты [2, 5]. Иммунорегуляторная активность фенольных соединений в системах in vitro может быть реализована различными механизмами, включая ингибирование воспалительных путей через NF-κB и STAT3, инфламмасому NLRP3 и, как следствие, снижения экспрессии провоспалительных генов в иммунокомпетентных клетках, уровня флогогенных цитокинов, ограничение окислительного стресса [7, 10, 11].

Особый интерес представляет потенциальное использование фитоэкстрактов совместно с МТХ, являющимся золотым стандартом лечения системных иммуновоспалительных заболеваний человека [8, 14]. Полученные в нашей работе данные совпадают с рядом литературных [7], где показано, что MTX снижает экспрессию TNFα, IL-1β, а также экспрессию IL-17 и IFNγ в Т-клетках, культивируемых совместно с синовиальными фибробластами при ревматоидном артрите [15]. Лечение MTX также приводило к снижению продукции провоспалительных моноцитарных/макрофагальных цитокинов (IL-1β, IL-6 и TNFα), увеличивало экспрессию гена противовоспалительных цитокинов Th2 (IL-4 и IL-10). Предполагают, что основной механизм влияния на провоспалительные цитокины был связан с преимущественным действием на путь NF-κB, а не через аденозиновые рецепторы. Вместе с тем в других работах показано, что МТХ был полностью неактивен в отношении продукции IL-6 мононуклеарами даже в больших дозах [13]. В серии экспериментов in vitro также не было обнаружено ингибирующего влияния МТХ на эффекторные цитокины, но показан выраженный ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток [9]. Авторы считали, что противовоспалительная эффективность MTX, вероятно, была опосредована ингибированием пролиферации и выживания активированных провоспалительных CD4 и CD8 Т-клеток. Вместе с тем в литературе отсутствуют сведения о возможном сочетанном провоспалительном эффекте МТХ с экстрактами клевера и цикория, что может способствовать снижению дозы МТХ для получения терапевтического эффекта препарата.

Выводы

1. Установлено ингибирующее влияние фитоэкстрактов клевера и цикория, а также их сочетаний с МТХ на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови человека – TNFα, IL-6, IL-17.
2. Показано потенцирующее влияние фитоэкстрактов на усиление ингибирующего эффекта цитостатика МТХ в отношении продукции лимфоцитами IL-6 и появление противоспалительного влияния в отношении TNFα и IL-17.
3. Наиболее выраженным иммунорегуляторным и потенцирующим эффектом в отношении противовоспалительного воздействия МТХ обладал фитоэкстракт цикория, при этом оба экстракта превосходили влияние препарата сравнения «Иммунал».

Об авторах

И. В. Михайлова

Оренбургский государственный медицинский университет

Email: a.a.sinegovets@yandex.ru

д.б.н., доцент, заведующая кафедрой фармацевтической химии

Россия, Оренбург

И. Н. Чайникова

Оренбургский государственный медицинский университет

Email: a.a.sinegovets@yandex.ru

д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии

Россия, Оренбург

Е. В. Иванова

Оренбургский государственный медицинский университет

Email: a.a.sinegovets@yandex.ru

д.м.н., доцент кафедры фармацевтической химии

Россия, Оренбург

А. А. Синеговец

Оренбургский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: a.a.sinegovets@yandex.ru

ассистент кафедры фармацевтической химии

Россия, Оренбург

Список литературы

Дополнительные файлы