Combined effect of methotrexate and phytoextracts of medow clover and common chicory on the in vitro production of pro-inflammatory cytokines

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Usage of herbal remedies may present a tool limiting toxicity of methotrexate (MTX). The herbal products are characterized by availability, safety, high biological activity, and very low toxicity. One should highlight the meadow clover and common chicory among medicinal plants containing a variety of biologically active polyphenolic substances, possessing antioxidant, anti-inflammatory, immunocorrective and other favorable properties. Phytoextracts obtained from these plants may be used in order to protect against immunosuppressive effects of MTX and enhance its anti-inflammatory properties without inducing MTX toxicity. At the same time, it should be noted that information on the mechanisms of anti-inflammatory activity of individual phytoextracts is multidirectional. The aim of our work was to evaluate the effect of clover and chicory phytoextracts on secretion of proinflammatory cytokines TNFα, IL-6 and IL-17 by human peripheral blood mononuclear cells under MTX-induced immunosuppression. Dry extracts from clover grass and chicory grass were obtained by percolation with ethyl alcohol. The production of cytokines TNFα, IL-6 and IL-17 in the supernatants of unstimulated and concanavalin A (Con A)- stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures was assessed using the enzyme immunoassay method. Evaluation of immunoregulatory activity of dry extracts from clover and chicory grass, as well as their combinations with MTX using the in vitro model of human peripheral blood mononuclear cells showed that the phytoextracts suppressed the production of proinflammatory cytokines in this system, both spontaneous (TNFα, IL-6), and induced (TNFα, IL-6 and IL-17). It should be noted that the degree of inhibitory effect caused by phytoextracts was not inferior, and, in relation to individual cytokines (TNFα and IL-17), was superior to Immunal, an Echinacea-derived preparation. We have revealed inhibitory effects of clover and chicory phytoextracts, as well as their combinations with MTX, on the production of proinflammatory cytokines (TNFα, IL-6, IL-17) by human peripheral blood mononuclear leukocytes. Potentiating action of phytoextracts manifested as enhanced inhibitory effect of cytostatic MTX on the production of IL-6 by lymphocytes and the appearance of an anti-inflammatory effect on TNFα and IL-17. The most pronounced immunoregulatory effect and potentiation of anti-inflammatory MTX action was obtained by the chicory phytoextract, with both extracts exceeding the effect of Immunal, a commercial comparison drug.

Full Text

Введение

В последние годы расширяется диапазон заболеваний, при лечении которых метотрексат (МТХ) используется как препарат первой линии и/или как основное и дополнительное лекарственное средство. Первоначально разработанный как противоопухолевый препарат, МТХ в настоящее время благодаря его противовоспалительному, антиметаболитному, иммуномодулирующему действию применяется при лечении ревматоидного артрита, ювенильного идиопатического артрита, псориаза, при воспалительных заболеваниях кишечника, рассеянном склерозе, васкулите, системной красной волчанке и многих других заболеваниях соединительной ткани и кожи [7]. Однако одним из факторов, ограничивающих применение МТХ, является его токсическое действие, в том числе способность индуцировать окислительный стресс, гепатоксичность, нефротоксичность, иммуносупрессию и др. [6, 12].

Одним из аспектов ограничения токсичности подобных препаратов является использование средств растительного происхождения, являющихся доступными, безопасными и обладающими высокой биологической активностью, включая способность потенцировать эффект лечебных препаратов. Клевер луговой (Trifolium pratense L.) и цикорий обыкновенный (Cichorium intybus L.) и экстракты, полученные из этих растений, содержат большой комплекс биологически активных веществ (БАВ) полифенольной природы, обладающих антиоксидантными, противовоспалительными, иммунокорригирующими и др. свойствами [1, 2, 5]. Вместе с тем разрозненный характер сведений о механизмах противовоспалительной активности индивидуальных фитоэкстрактов, связанный с особенностями их выделения, а также очистки и стандартизации фитопрепаратов, ограничивает возможности целенаправленного поиска БАВ с противовоспалительной активностью в использующихся и перспективных лекарственных растениях. Следует также отметить, что вопрос о защитном влиянии экстрактов цикория и клевера в отношении иммунодепрессивного влияния МТХ остается открытым. Целью работы явилась оценка влияния фитоэкстрактов клевера и цикория на секрецию провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-17 мононуклеарными клетками периферической крови человека при МТХ-индуцированной иммуносупрессии.

Материалы и методы

Объектами исследования послужили сухие экстракты из травы клевера лугового и травы цикория обыкновенного, полученные методом перколяции [3, 4]. Периферические мононуклеарные клетки (ПМК) выделяли из гепаринизированной крови здоровых доноров методом градиентного центрифугирования (400 g) в градиенте плотности фиколл-верографин (Pharmacia, Швеция) плотностью 1,077 г/см3. Базовая (нестимулированная) продукция провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-17 исследовалась в культуре мононуклеаров, сокультивируемых с водными растворами фитоэкстрактов (2,0 мг/мл) с добавлением МТХ (Sandoz, Словения; лекарственная форма – раствор для инъекций) в концентрации 10,0 мкг/мл (опыт 1) и без МТХ (опыт 2). Для оценки индуцированной продукции исследуемых провоспалительных цитокинов к лимфоцитам добавляли конканавалин A (Кон А) (НПП «ПанЭко», Россия) в концентрации 20,0 мкг/мл. В качестве контроля были использованы пробы, где к периферическим мононуклеарам добавлялась только культуральная среда (контроль 1) или культуральная среда с Кон А (контроль 2). После 24-часовой инкубации клеток (2 × 106) при 37,0 °С в атмосфере 5,0% СО2 в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10,0% фетальной сыворотки (НПП «ПанЭко», Россия) и 80,0 мкг/мл гентамицина собирали культуральную жидкость и замораживали (-20 °С). Исследования проводили в 3 дублях для каждого исследуемого образца. Уровень спонтанной и индуцированной продукции цитокинов после сокультивирования лимфоцитов с водными растворами фитоэкстрактов исследовали методом ИФА (ООО «Цитокин», Россия) с регистрацией результатов на фотометре Multiskan (Labsystems, Финляндия), длина волны 492 нм. Статистическую обработку полученных данных проводили средствами пакета Statistica 10 (StatSoft, США) с оценкой различий между величинами по критерию Манна–Уитни (р < 0,05).

Результаты и обсуждение

Оценка иммунорегуляторной активности сухих экстрактов травы клевера и цикория на модели мононуклеаров периферической крови человека показала, что фитоэкстракты подавляли продукцию провоспалительных цитокинов в системе in vitro как спонтанную (TNFα, IL-6), так и индуцированную (TNFα, IL-6 и IL-17). Следует отметить, что выраженность ингибирующего эффекта фитоэкстрактов не уступала, а в отношении отдельных цитокинов (TNFα и IL-17) превосходила фитопрепарат «Иммунал». Так, добавление в среду культивирования ПМК фитоэкстракта клевера и цикория сопровождалось снижением базовой и индуцированной продукции ключевого провоспалительного цитокина TNFα в 2 и 4 раза относительно контролей лимфоцитов (136,5 ± 13,8 пг/мл и 239,9 ± 24,2 пг/ мл соответственно, р < 0,05). Напротив, препарат «Иммунал» оказывал стимулирующее влияние на базовую продукцию TNFα (191,2 ± 14,5 пг/мл), не изменяя индуцированную секрецию.

В отношении IL-6 эффекты исследуемых образцов были однонаправленными и характеризовались подавлением базовой и индуцированной продукции цитокина лимфоцитами, но отличались по уровню выраженности влияния. Добавление к периферическим мононуклеарам «Иммунала» приводило к незначительному снижению уровня IL-6 (на 18,0-30,5%) относительно контролей (433,7 ± 16,0 пг/мл и 469,0 ± 18,5 пг/мл соответственно, р < 0,05). Внесение в культуральную среду экстракта клевера сопровождалось уменьшением продукции IL-6 в 2 раза у нестимулированных лимфоцитов и в 3 раза у индуцированных клеток. Наиболее сильное ингибирующее влияние на продукцию лимфоцитами цитокина оказывал фитоэкстракт цикория, снижающий уровень IL-6 в 20 раз, независимо от присутствия в среде Кон А.

Содержание другого провоспалительного цитокина IL-17 в культуральной среде нестимулированных лимфоцитов в присутствии обоих фитоэкстрактов и «Иммунала» не отличалось от уровня базовой секреции данного цитокина и соответствовало значениям контроля (38,3 ± 4,5 пг/ мл). Вместе с тем внесение исследуемых образцов в среду индуцированных Кон А лимфоцитов приводило к двухкратному снижению продукции IL-17 под влиянием «Иммунала» и к двадцатикратному – в присутствии обоих фитоэкстрактов по сравнению с контролем 1 (631,7 ± 58,3 пг/мл, р < 0,05).

Анализ сочетанного влияния фитоэкстрактов и «Иммунала» совместно с МТХ позволил установить их ингибирующий эффект в отношении продукции TNFα, IL-6 и IL-17 лимфоцитами, при этом более выраженным потенцирующим действием обладал образец из сухой травы цикория. В предварительных исследованиях было установлено отсутствие влияния самого МТХ в концентрации 10,0 мкг/мл в отношении базовой и стимулированной продукции TNFα и IL-17. Вместе с тем МТХ способствовал снижению уровня IL-6 до 358,0 ± 29,5 пг/мл в среде с не стимулированными ПМК и до 367,0 ± 32,0 пг/мл – с лимфоцитами, индуцированными Кон А. При внесении в культуральную среду «Иммунала» с МТХ отмечалась синергидность их противовоспалительного эффекта, но только для продукции TNFα и IL-17. В отношении TNFα установлено появление ингибирующего воздействия обоих образцов, для IL-17 – усиление эффекта на два порядка в сравнении с непосредственным влиянием «Иммунала» (с 631,7 ± 58,3 пг/мл до 250,1 ± 21,4 пг/мл и 130,7 ± 18,9 пг/мл соответственно, р < 0,05). В отношении базовой и стимулированной продукции IL-6 сочетанный противовоспалительный эффект не отмечался и соответствовал влиянию препаратов в отдельности.

В сочетании с фитоэкстрактом клевера на порядок усиливался противовоспалительный эффект МТХ в отношении базовой и стимулированной продукции TNFα и IL-6 (р < 0,05). Для IL-17 ингибирующий эффект соответствовал влиянию отдельно взятому образцу клевера на продукцию индуцированных лимфоцитов. Добавление к периферическим мононуклеарам цитостатика MTX с фитоэкстрактом цикория сопровождалось двухкратным (в сравнении с контролем лимфоцитов – 77,4 ± 11,0 пг/мл и 81,5 ± 6,5 пг/мл, р < 0,05) снижением продукции TNFα и многократным (в 19-20 раз в сравнении с контролем, р < 0,05) подавлением продукции IL-6 и IL-17 как у нестимулированных лимфоцитов, так и индуцированных Кон А.

Таким образом, было установлено ингибирующее влияние фитоэкстрактов клевера и цикория, а также их сочетаний с МТХ на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови человека – TNFα, IL-6, IL-17. Показано потенцирующее влияние фитоэкстрактов на усиление ингибирующего эффекта цитостатика МТХ в отношении продукции лимфоцитами IL-6 и появление противоспалительного влияния в отношении TNFα и IL-17. Наиболее выраженным иммунорегуляторным и потенцирующим эффектом в отношении противовоспалительного воздействия МТХ обладал фитоэкстракт цикория, однако оба экстракта превосходили влияние известного фитопрепарата на основе Echinacea purpurea L.

Обсуждая полученные результаты, необходимо отметить, что в ранее проведенных работах было установлено, что исследуемое сырье Trifolium pratense L. и Cichorium intybus L. и полученные из него экстракты содержат БАВ полифенольной природы – флавоноиды, гидроксикоричные кислоты и фенольные кислоты [2, 5]. Иммунорегуляторная активность фенольных соединений в системах in vitro может быть реализована различными механизмами, включая ингибирование воспалительных путей через NF-κB и STAT3, инфламмасому NLRP3 и, как следствие, снижения экспрессии провоспалительных генов в иммунокомпетентных клетках, уровня флогогенных цитокинов, ограничение окислительного стресса [7, 10, 11].

Особый интерес представляет потенциальное использование фитоэкстрактов совместно с МТХ, являющимся золотым стандартом лечения системных иммуновоспалительных заболеваний человека [8, 14]. Полученные в нашей работе данные совпадают с рядом литературных [7], где показано, что MTX снижает экспрессию TNFα, IL-1β, а также экспрессию IL-17 и IFNγ в Т-клетках, культивируемых совместно с синовиальными фибробластами при ревматоидном артрите [15]. Лечение MTX также приводило к снижению продукции провоспалительных моноцитарных/макрофагальных цитокинов (IL-1β, IL-6 и TNFα), увеличивало экспрессию гена противовоспалительных цитокинов Th2 (IL-4 и IL-10). Предполагают, что основной механизм влияния на провоспалительные цитокины был связан с преимущественным действием на путь NF-κB, а не через аденозиновые рецепторы. Вместе с тем в других работах показано, что МТХ был полностью неактивен в отношении продукции IL-6 мононуклеарами даже в больших дозах [13]. В серии экспериментов in vitro также не было обнаружено ингибирующего влияния МТХ на эффекторные цитокины, но показан выраженный ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток [9]. Авторы считали, что противовоспалительная эффективность MTX, вероятно, была опосредована ингибированием пролиферации и выживания активированных провоспалительных CD4 и CD8 Т-клеток. Вместе с тем в литературе отсутствуют сведения о возможном сочетанном провоспалительном эффекте МТХ с экстрактами клевера и цикория, что может способствовать снижению дозы МТХ для получения терапевтического эффекта препарата.

Выводы

  1. Установлено ингибирующее влияние фитоэкстрактов клевера и цикория, а также их сочетаний с МТХ на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови человека – TNFα, IL-6, IL-17.
  2. Показано потенцирующее влияние фитоэкстрактов на усиление ингибирующего эффекта цитостатика МТХ в отношении продукции лимфоцитами IL-6 и появление противоспалительного влияния в отношении TNFα и IL-17.
  3. Наиболее выраженным иммунорегуляторным и потенцирующим эффектом в отношении противовоспалительного воздействия МТХ обладал фитоэкстракт цикория, при этом оба экстракта превосходили влияние препарата сравнения «Иммунал».
×

About the authors

I. V. Mikhailova

Orenburg State Medical University

Email: a.a.sinegovets@yandex.ru

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head of the Department of Pharmaceutical Chemistry

Russian Federation, Orenburg

I. N. Chaynikova

Orenburg State Medical University

Email: a.a.sinegovets@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Professor at the Department of Normal Physiology

Russian Federation, Orenburg

E. V. Ivanova

Orenburg State Medical University

Email: a.a.sinegovets@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Associate Professor at the Department of Pharmaceutical Chemistry

Russian Federation, Orenburg

A. A. Sinegovets

Orenburg State Medical University

Author for correspondence.
Email: a.a.sinegovets@yandex.ru

Assistant Professor at the Department of Pharmaceutical Chemistry

Russian Federation, Orenburg

References

  1. Drenin A.A., Botirov E.H. Flavonoids and isoflavonoids of plants of the genus Trifolium L. Structural diversity and biological activity. Khimiya rastitelnogo syrya = Chemistry of Plant Raw Materials, 2017, no. 3, pp. 39-53. (In Russ.)
  2. Mikhailova I.V., Sinegovets A.A., Bondarenko A.I., Ivanova E.V. Phytochemical characteristics and antioxidant properties of the herb of meadow clover growing on the territory of the Orenburg region. Mediko-farmatsevticheskiy zhurnal “Puls” = Medical and Pharmaceutical Journal “Pulse”, 2023, Vol. 25, no. 1, pp. 29-33. (In Russ.)
  3. Mikhailova I.V., Ivanova E.V., Sinegovets A.A., Smolyagin A.I., Kuzmicheva N.A. Method for producing an agent with antioxidant and immunomodulatory activity based on the herb Trifolium pratense L. Patent RU 2828665 C1, 15.10.2024.
  4. Mikhailova I.V., Ivanova E.V., Smolyagin A.I., Bondarenko A.A., Sinegovets A.A., Kuzmicheva N.A., Filippova Yu.V., Voronkova I.P., Vinokurova N.V. Method for producing an agent with antioxidant and immunomodulatory activity. Patent RU 2803502 C1, 14.09.2023.
  5. Sinegovets A.A., Mikhailova I.V., Ivanova E.V., Kuzmicheva N.A. Selection of optimum parameters for extraction of phenolic compounds from the herb of Cichorium intybus L. Mediko-farmatsevticheskiy zhurnal “Puls” = Medical and Pharmaceutical Journal “Pulse”, 2023, Vol. 25, no. 8, pp. 58-67. (In Russ.)
  6. Frolov B.A., Kalinina O.V., Kirillova A.V., Shtil A.A. Overcoming the hepatotoxicity of methotrexate: the role of triterpenoids. Klinicheskaya onkogematologiya = Clinical Hematology. 2013, Vol. 6, no. 1, pp. 1-10. (In Russ.)
  7. Bedoui Y., Guillot X., Sélambarom J., Guiraud P., Giry C., Jaffar-Bandjee M.C., Ralandison S., Gasque P. Methotrexate an old drug with new tricks. Int. J. Mol. Sci., 2019, Vol. 20, no. 20, 5023. doi: 10.3390/ijms20205023.
  8. Cronstein B.N., Aune T.M. Methotrexate and its mechanisms of action in inflammatory arthritis. Nat. Rev. Rheumatol., 2020, Vol. 16, no. 3, pp. 145-154.
  9. Freeman M.L., Clagett B.M., Moisi D., Yeh E., Morris C.D., Ryu A., Rodriguez B., Stein J.H., Deeks S.G., Currier J.S., Hsue P.Y., Anthony D.D., Calabrese L.H., Ribaudo H.J., Lederman M.M. Methotrexate inhibits T cell proliferation but not inflammatory cytokine expression to modulate immunity in people living with HIV. Front. Immunol., 2022, Vol.13, 924718. doi: 10.3389/fimmu.2022.924718.
  10. Hosseinzade A., Sadeghi O., Naghdipour Biregani A., Soukhtehzari S., Brandt G.S., Esmaillzadeh A. Immunomodulatory effects of flavonoids: possible induction of T CD4+ regulatory cells through suppression of mTOR pathway signaling activity. Front. Immunol., 2019, Vol. 10, 51. doi: 10.3389/fimmu.2019.00051.
  11. Martínez G., Mijares M.R., De Sanctis J.B. Effects of flavonoids and its derivatives on immune cell responses. Recent Pat. Inflamm. Allergy Drug Discov., 2019, Vol. 13, no. 2, pp. 84-104.
  12. Miyazono Y., Gao F., Horie T. Oxidative stress contributes to methotrexate-induced small intestinal toxicity in rats. Scand. J. Gastroenterol., 2004, Vol. 39, no. 11, pp. 1119-1127.
  13. Sakuma S., Kato Y., Nishigaki F., Magari K., Miyata S., Ohkubo Y., Goto T. Effects of FK506 and other immunosuppressive anti-rheumatic agents on T cell activation mediated IL-6 and IgM production in vitro. Int. Immunopharmacol., 2001, Vol. 1, no. 4, pp. 749-757.
  14. Shinde C.G., Venkatesh M.P., Kumar T.M., Shivakumar H.G. Methotrexate: a gold standard for treatment of rheumatoid arthritis. J. Pain Palliat. Care Pharmacother., 2014, Vol. 28, no. 4, pp. 351-358.
  15. Xu W., Wu H., Tahara K., Chen S., Wang X., Tanaka S., Sugiyama K., Sawada T., Hirano T. Effects of vitamin K2 combined with methotrexate against mitogen-activated peripheral blood mononuclear cells of healthy subjects and rheumatoid arthritis patients. Fundam. Сlin. Pharmacol., 2021, Vol. 35, no. 5, pp. 832-842.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2025 Mikhailova I.V., Chaynikova I.N., Ivanova E.V., Sinegovets A.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies