Monocyte culture as a model for in vitro testing of pharmaceutical compositions

Marina V. Nikolenko; Николенко Марина Викторовна; Elena G. Kostolomova; Костоломова Елена Геннадьевна; Darya S. Sivkova; Сивкова Дарья Сергеевна; Anastasiya I. Borisenok; Борисенок Анастасия Ивановна; Natalia V. Baryshnikova; Барышникова Наталья Викторовна; Olga I. Malishevskaya; Малишевская Ольга Ивановна; Ekaterina M. Vaseva; Васева Екатерина Михайловна; Yulia S. Prikhodko; Приходько Юлия Сергеевна

doi:10.46235/1028-7221-17170-MCA

Культура моноцитов как модель для тестирования фармацевтических композиций in vitro

Авторы: Николенко М.В.¹, Костоломова Е.Г.¹, Сивкова Д.С.¹, Борисенок А.И.¹, Барышникова Н.В.¹, Малишевская О.И.¹, Васева Е.М.¹, Приходько Ю.С.¹
Учреждения:
1. ФГБОУ ВО «Тюменский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ
Выпуск: Том 28, № 3 (2025)
Страницы: 393-398
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Дата подачи: 29.03.2025
Дата принятия к публикации: 25.05.2025
Дата публикации: 07.09.2025
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/17170
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-17170-MCA
ID: 17170

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Целью исследования являлось изучение иммунотропных эффектов фармацевтической композиции на основе метаболитов пробиотического штамма и растительных компонентов различного происхождения на моноциты человека in vitro. Авторами предложен экзометаболит Saccharomyces boulardii (S. boulardii) как основа всех предлагаемых составов для регенерации эпителиоцитов человека. В состав смесей входили экстракт зверобоя и масло кориандра. Эффективность полученных фармацевтических средств оценивали на моноцитах взрослого человека. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли методом градиентного центрифугирования. Моноциты высевали в 24-луночные планшеты, сокультивировали с исследуемыми композициями (опыт) и без добавления композиций (контроль). Для идентификации поверхностных маркеров линии моноцитов/макрофагов использовались моноклональные антитела. Фенотипический анализ моноцитов проводили с помощью проточного цитофлуориметра CytoFLEX. Характеристика фенотипа M2 проводилась с использованием антител CD204, CD163 и CD206, тогда как фенотип M1 исследовался с использованием антител CD80 и CD86. Экспериментально доказано, что сокультивирование с экстрактом зверобоя индуцировало культивируемые моноциты к приобретению фенотипа M1, при этом наблюдалось достоверное повышение экспрессии всех поверхностных маркеров для TLR4 CD80 и CD86. Экспрессию маркеров фенотипа М2 по сравнению с нестимулированными клетками, экстракт кориандра напротив, достоверно подавлял. Процентное соотношение моноцитов M2-фенотипа CD204+, CD206+, CD163+ было увеличено после совместного культивирования как с маслом, так и после сокультивирования с метаболитами S. boulardii для всех исследуемых маркеров. Воздействие масла кориандра, так и смеси №1 значительно снизило экспрессию генов всех маркеров M1: TLR4, CD80, CD86. Понижающий эффект экспрессии маркеров M1 сохранялся после добавления метаболитов S. boulardii только для TLR4 и CD 86 по сравнению с контролем. Субпопуляция моноцитов фенотипа TLR4+, CD204+, CD206+, CD163+, коэкспрессирующие маркеры поляризации M1 и M2 выявлены при сокультивировании со смесями как 2, так и 3. Процент гибридных TLR4+М2-моноцитов был значительно выше в смеси 2 по сравнению со смесью 3 (p < 0,001 и p < 0,05 соответственно). Таким образом, различные исследуемые смеси вызывают поляризацию моноцитов в М1/M2 в зависимости от состава композиции, что позволит рекомендовать к использованию в косметологии и, возможно, лечебной практике в зависимости от этиологии заболевания.

Ключевые слова

моноциты, метаболиты, экстракт зверобоя, масло кориандра, интерлейкины, цитокины

Полный текст

Введение

Возможность использования краткосрочной культуры моноцитов, фибробластов, полиморфноядерных лейкоцитов, выделенных из периферической донорской крови, для оценки биологической активности различных типов биоразлагаемых полимерных частиц, волокнистых и пленочных субстратов микро- и наноразмеров, фуллеренов, различных фармацевтических композиций потенциально разрабатывается в настоящее время. Бесклеточные супернатанты микроорганизмов обладают широким спектром разнообразных иммунологических эффектов. В литературе имеются сообщения о том, что метаболиты пробиотических штаммов обладают как противовоспалительными, так и провоспалительными свойствами [1].

Моноциты представляют собой пластичные клетки, способные переключать свой фенотип в ответ на стимулы и сигналы микроокружения [6]. На основании экспрессии маркеров клеточной поверхности, продукции специфических цитокинов и биологической активности клеток было описано две основные субпопуляции моноцитов: классически активированные или воспалительные M1 и альтернативно активированные или противовоспалительные M2. Парадигма M1/M2 возникла аналогично парадигме Th1/Th2, описанной ранее для T-хелперов в зависимости от участия в различных типах иммунного ответа [4].

Цель исследования – изучить иммунотропные эффекты фармацевтической композиции на основе метаболитов пробиотического штамма и растительных компонентов различного происхождения на моноциты человека in vitro.

Материалы и методы

Фармацевтические композиции содержали метаболит, полученный из дрожжей Saccharomyces boulardii (S. boulardii) по методике Перуновой Н.Б. с соавт. [2011]. Культивирование S. boulardii проводилось на бульоне Шедлера при 37 °C в течение 24 часов. Стерильность супернатантов проверяли путем высева на 5% кровяной агар с последующим инкубированием при 37 °C в течение 24 ч. Полученный экзометаболит S. boulardii являлся основой всех предлагаемых составов для регенерации эпителиоцитов человека. В композицию № 1 добавляли 7% масла кориандра от общего объема. Фармацевтическая композиция № 2 содержала 0,7 мл экстракта травы зверобоя продырявленного. Вариант № 3 содержал сочетанное произведение масла кориандра и травы зверобоя продырявленного. Отдельно исследовали стерильные бесклеточные супернатанты S. boulardii, масло кориандра и экстракт травы зверобоя. Эффективность полученных фармацевтических средств оценивали на моноцитах взрослого человека.

В исследование были включены 6 человек условно здоровых лиц без острой соматической патологии на момент обследования, (3 мужчин и 3 женщин, средний возраст 34±14 лет). Исследования выполнялись в день забора крови. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли методом градиентного центрифугирования (400 g) в градиенте плотности фиколл-верографин (Pharmacia, Швеция) ρ = 1,077г/см3. Оценку иммуномодулирующей активности фармацевтических композиций проводили на модели клеток врожденного и адаптивного иммунитета в эксперименте in vitro [2]. Моноцитарную фракцию получали, используя способность клеток моноцитарно-макрофагального ряда прилипать к стеклу и пластику. Для этого суспензию МНК в концентрации 2 × 106 кл/мл культивируют в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, США) и 80 мкг/ мл гентамицина, в СО2 инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% СО2. Через 40 мин собирали не прилипающие клетки, а прилипающие клетки (моноциты) снимали со дна чашки охлажденным (4-6 °С) раствором Версена, который заливали по 1 мл в чашку сразу после удаления надосадочной жидкости. Через 1-2 мин собирали моноциты, помещали в силиконированные центрифужные пробирки. Центрифугировали при 200 g в течение 10 мин. Удаляли надосадочную жидкость и моноциты ресуспендировали в полной культуральной среде. Моноциты высевали в количестве 1 × 106 в 24-луночные планшеты сокультивировали с исследуемыми композициями (опыт) и без добавления композиций (контроль). Культивировали в полной культуральной среде в СО2 инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% СО2 в течение 24 часов. Фенотипический анализ моноцитов проводили с помощью проточного цитофлуориметра CytoFLEX (Beckman Coulter, США). Для этого 100 мкл моноциты инкубировали в течение 30 мин с 10 мкл моноклональных антител. Для идентификации поверхностных маркеров линии моноцитов/макрофагов использовались моноклональные антитела (Beckman Coulter, США) CD14. Характеристика фенотипа M2 проводилась с использованием антител CD204, CD163 и CD206, тогда как фенотип M1 исследовался с использованием антител CD80 и CD86.

Результаты и обсуждение

Макрофаги представляют собой гетерогенную популяцию клеток, играющую важную роль в защитных механизмах и гомеостазе. Макрофаги M1 характеризуются повышенным уровнем экспрессии костимулирующих молекул CD80 и CD86 и толл-подобного рецептора 4 (TLR4). Этот тип макрофагов склонен вырабатывать провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли (TNF) α, интерлейкин (IL)-1β и IL-6, а также вырабатывать оксид азота (NO) или реактивные кислородные интермедиаты (ROI) для защиты от патогенов [5]. Напротив, поляризованные макрофаги M2 экспрессируют высокие уровни поверхностных маркеров CD 204, CD 163 и CD 206. А также способствуют выработке противовоспалительных цитокинов, таких как IL- 10, трансформирующий фактор роста β (TGF-β), и вырабатывают полиамины и пролин, которые способствуют разрешению воспаления и восстановлению тканей [6].

Экспериментально доказано, что сокультивирование с экстрактом зверобоя индуцировало культивируемые моноциты к приобретению фенотипа M1, при этом наблюдалось достоверное повышение экспрессии всех поверхностных маркеров для TLR4 (p < 0,05), а также CD80 и CD86 (p < 0,01) по сравнению с нестимулированными клетками. В то же время экстракт зверобоя значительно подавлял экспрессию маркеров фенотипа М2 по сравнению с нестимулированными CD163 и CD206 (p < 0,01), CD204 (p < 0,05). Процентное соотношение моноцитов M2-фенотипа CD204+, CD206+, CD163+ было значительно увеличено после совместного культивирования как с маслом кориандра по сравнению с контролем (p < 0,01; p < 0,05; p < 0,001 соответственно), так и после сокультивирования с метаболитами S. boulardii (p < 0,01) для всех исследуемых маркеров. Аналогичный ответ наблюдался при добавлении смеси 1, где одним из компонентов является масло кориандра (CD163, CD204 и CD206 (p < 0,05) по сравнению с необработанными). Как воздействие масла кориандра, так и смеси 1 значительно снизило экспрессию генов всех маркеров M1: TLR4, CD80, CD86 (p < 0,01 по сравнению с необработанными). Понижающий эффект экспрессии маркеров M1 сохранялся после добавления метаболитов S. boulardii только для TLR4 и CD 86 по сравнению с контролем (p < 0,05 для обоих маркеров). Моноциты («гибридные» моноциты), коэкспрессирующие маркеры поляризации M1 и M2, наблюдались при сокультивировании со смесями 2, и 3. Процент циркулирующих гибридных TLR4+M2 был обнаружен значительно выше в смеси 2 по сравнению со смесью 3 (p < 0,001 и p < 0,05 соответственно) и с гиперплазией хрящевых клеток (для обеих популяций клеток).

Выводы

Исследуемые смеси вызывают поляризацию моноцитов в М1/M2 в зависимости от состава композиции. В этой связи их можно рекомендовать к использованию в косметологии и, возможно, в лечебной практике, в зависимости от этиологии заболевания и желаемого исхода.

Благодарности

Коллектив авторов выражает благодарность ректору Тюменского ГМУ И.М. Петрову, проректору по научно-исследовательской работе и инновационной политике Е.Б. Храмовой.