Monocyte culture as a model for in vitro testing of pharmaceutical compositions

Marina V. Nikolenko; Николенко Марина Викторовна; Elena G. Kostolomova; Костоломова Елена Геннадьевна; Darya S. Sivkova; Сивкова Дарья Сергеевна; Anastasiya I. Borisenok; Борисенок Анастасия Ивановна; Natalia V. Baryshnikova; Барышникова Наталья Викторовна; Olga I. Malishevskaya; Малишевская Ольга Ивановна; Ekaterina M. Vaseva; Васева Екатерина Михайловна; Yulia S. Prikhodko; Приходько Юлия Сергеевна

doi:10.46235/1028-7221-17170-MCA

Monocyte culture as a model for in vitro testing of pharmaceutical compositions

Authors: Nikolenko M.V.¹, Kostolomova E.G.¹, Sivkova D.S.¹, Borisenok A.I.¹, Baryshnikova N.V.¹, Malishevskaya O.I.¹, Vaseva E.M.¹, Prikhodko Y.S.¹
Affiliations:
1. Tyumen State Medical University
Issue: Vol 28, No 3 (2025)
Pages: 393-398
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 29.03.2025
Accepted: 25.05.2025
Published: 07.09.2025
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/17170
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-17170-MCA
ID: 17170

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

This study aimed to investigate the immunotropic effects of a pharmaceutical composition based on a probiotic strain metabolites, and plant components of various origin using an in vitro model of human monocyte culture. The authors propose a mixture of exometabolites from Saccharomyces boulardii (S. boulardii) as the basis of all suggested formulations aimed at regeneration of human epithelial cells. The compositions included St. John’s wort extract and coriander oil. The effectiveness of these pharmaceutical compositions was evaluated using monocytes isolated from adult donors. Mononuclear cells (MNCs) were isolated by gradient centrifugation. The monocytes were seeded into 24-well plates, co-cultured with the studied compositions (experimental samples) and without compositions (controls). Monoclonal antibodies were used to identify cell markers of monocyte/macrophage lineage. Phenotypic analysis of monocytes was performed using a CytoFLEX flow cytometer. The M2 phenotype was characterized using CD204, CD163, and CD206 antibodies, whereas the M1 phenotype was assessed using CD80 and CD86 antibodies. It was proven that co-cultivation with St. John’s wort extract induced cultured monocytes to acquire the M1 phenotype, while a significantly increased expression of all surface markers for TLR4, CD80, and CD86 was observed. In contrast, the coriander extract (mixture #1) significantly inhibited the expression of M2 phenotype markers compared with unstimulated cells. The percentage of M2 monocytes (CD204+, CD206+, and CD163+ phenotypes) was increased after co-cultivation with both oil and after co-cultivation with S. boulardii metabolites for all the studied markers. Exposure to coriander oil and mixture No. 1 significantly reduced the gene expression of all M1 markers, i.e. TLR4, CD80, CD86. The reducing effect of M1 marker expression persisted after addition of S. boulardii metabolites only for TLR4 and CD86 compared with the control. A subpopulation of monocytes with TLR4+, CD204+, CD206+, CD163+ phenotype, coexpressing the M1 and M2 polarization markers was detected during co-cultivation with both mixtures #2 and #3. The percentage of hybrid TLR4 +M2 monocytes was significantly higher in mixture 2 compared with mixture 3 (p < 0.001 and p < 0.05, respectively). Hence, the mixtures under study cause M1/M2 monocyte polarization depending on the composition, thus recommending its potential usage in cosmetology and medical practice, depending on etiology of the disease.

Keywords

monocytes, metabolites, St. John’s wort extract, coriander oil, interleukins, cytokines

Full Text

Введение

Возможность использования краткосрочной культуры моноцитов, фибробластов, полиморфноядерных лейкоцитов, выделенных из периферической донорской крови, для оценки биологической активности различных типов биоразлагаемых полимерных частиц, волокнистых и пленочных субстратов микро- и наноразмеров, фуллеренов, различных фармацевтических композиций потенциально разрабатывается в настоящее время. Бесклеточные супернатанты микроорганизмов обладают широким спектром разнообразных иммунологических эффектов. В литературе имеются сообщения о том, что метаболиты пробиотических штаммов обладают как противовоспалительными, так и провоспалительными свойствами [1].

Моноциты представляют собой пластичные клетки, способные переключать свой фенотип в ответ на стимулы и сигналы микроокружения [6]. На основании экспрессии маркеров клеточной поверхности, продукции специфических цитокинов и биологической активности клеток было описано две основные субпопуляции моноцитов: классически активированные или воспалительные M1 и альтернативно активированные или противовоспалительные M2. Парадигма M1/M2 возникла аналогично парадигме Th1/Th2, описанной ранее для T-хелперов в зависимости от участия в различных типах иммунного ответа [4].

Цель исследования – изучить иммунотропные эффекты фармацевтической композиции на основе метаболитов пробиотического штамма и растительных компонентов различного происхождения на моноциты человека in vitro.

Материалы и методы

Фармацевтические композиции содержали метаболит, полученный из дрожжей Saccharomyces boulardii (S. boulardii) по методике Перуновой Н.Б. с соавт. [2011]. Культивирование S. boulardii проводилось на бульоне Шедлера при 37 °C в течение 24 часов. Стерильность супернатантов проверяли путем высева на 5% кровяной агар с последующим инкубированием при 37 °C в течение 24 ч. Полученный экзометаболит S. boulardii являлся основой всех предлагаемых составов для регенерации эпителиоцитов человека. В композицию № 1 добавляли 7% масла кориандра от общего объема. Фармацевтическая композиция № 2 содержала 0,7 мл экстракта травы зверобоя продырявленного. Вариант № 3 содержал сочетанное произведение масла кориандра и травы зверобоя продырявленного. Отдельно исследовали стерильные бесклеточные супернатанты S. boulardii, масло кориандра и экстракт травы зверобоя. Эффективность полученных фармацевтических средств оценивали на моноцитах взрослого человека.

В исследование были включены 6 человек условно здоровых лиц без острой соматической патологии на момент обследования, (3 мужчин и 3 женщин, средний возраст 34±14 лет). Исследования выполнялись в день забора крови. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли методом градиентного центрифугирования (400 g) в градиенте плотности фиколл-верографин (Pharmacia, Швеция) ρ = 1,077г/см3. Оценку иммуномодулирующей активности фармацевтических композиций проводили на модели клеток врожденного и адаптивного иммунитета в эксперименте in vitro [2]. Моноцитарную фракцию получали, используя способность клеток моноцитарно-макрофагального ряда прилипать к стеклу и пластику. Для этого суспензию МНК в концентрации 2 × 106 кл/мл культивируют в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, США) и 80 мкг/ мл гентамицина, в СО2 инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% СО2. Через 40 мин собирали не прилипающие клетки, а прилипающие клетки (моноциты) снимали со дна чашки охлажденным (4-6 °С) раствором Версена, который заливали по 1 мл в чашку сразу после удаления надосадочной жидкости. Через 1-2 мин собирали моноциты, помещали в силиконированные центрифужные пробирки. Центрифугировали при 200 g в течение 10 мин. Удаляли надосадочную жидкость и моноциты ресуспендировали в полной культуральной среде. Моноциты высевали в количестве 1 × 106 в 24-луночные планшеты сокультивировали с исследуемыми композициями (опыт) и без добавления композиций (контроль). Культивировали в полной культуральной среде в СО2 инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% СО2 в течение 24 часов. Фенотипический анализ моноцитов проводили с помощью проточного цитофлуориметра CytoFLEX (Beckman Coulter, США). Для этого 100 мкл моноциты инкубировали в течение 30 мин с 10 мкл моноклональных антител. Для идентификации поверхностных маркеров линии моноцитов/макрофагов использовались моноклональные антитела (Beckman Coulter, США) CD14. Характеристика фенотипа M2 проводилась с использованием антител CD204, CD163 и CD206, тогда как фенотип M1 исследовался с использованием антител CD80 и CD86.

Результаты и обсуждение

Макрофаги представляют собой гетерогенную популяцию клеток, играющую важную роль в защитных механизмах и гомеостазе. Макрофаги M1 характеризуются повышенным уровнем экспрессии костимулирующих молекул CD80 и CD86 и толл-подобного рецептора 4 (TLR4). Этот тип макрофагов склонен вырабатывать провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли (TNF) α, интерлейкин (IL)-1β и IL-6, а также вырабатывать оксид азота (NO) или реактивные кислородные интермедиаты (ROI) для защиты от патогенов [5]. Напротив, поляризованные макрофаги M2 экспрессируют высокие уровни поверхностных маркеров CD 204, CD 163 и CD 206. А также способствуют выработке противовоспалительных цитокинов, таких как IL- 10, трансформирующий фактор роста β (TGF-β), и вырабатывают полиамины и пролин, которые способствуют разрешению воспаления и восстановлению тканей [6].

Экспериментально доказано, что сокультивирование с экстрактом зверобоя индуцировало культивируемые моноциты к приобретению фенотипа M1, при этом наблюдалось достоверное повышение экспрессии всех поверхностных маркеров для TLR4 (p < 0,05), а также CD80 и CD86 (p < 0,01) по сравнению с нестимулированными клетками. В то же время экстракт зверобоя значительно подавлял экспрессию маркеров фенотипа М2 по сравнению с нестимулированными CD163 и CD206 (p < 0,01), CD204 (p < 0,05). Процентное соотношение моноцитов M2-фенотипа CD204+, CD206+, CD163+ было значительно увеличено после совместного культивирования как с маслом кориандра по сравнению с контролем (p < 0,01; p < 0,05; p < 0,001 соответственно), так и после сокультивирования с метаболитами S. boulardii (p < 0,01) для всех исследуемых маркеров. Аналогичный ответ наблюдался при добавлении смеси 1, где одним из компонентов является масло кориандра (CD163, CD204 и CD206 (p < 0,05) по сравнению с необработанными). Как воздействие масла кориандра, так и смеси 1 значительно снизило экспрессию генов всех маркеров M1: TLR4, CD80, CD86 (p < 0,01 по сравнению с необработанными). Понижающий эффект экспрессии маркеров M1 сохранялся после добавления метаболитов S. boulardii только для TLR4 и CD 86 по сравнению с контролем (p < 0,05 для обоих маркеров). Моноциты («гибридные» моноциты), коэкспрессирующие маркеры поляризации M1 и M2, наблюдались при сокультивировании со смесями 2, и 3. Процент циркулирующих гибридных TLR4+M2 был обнаружен значительно выше в смеси 2 по сравнению со смесью 3 (p < 0,001 и p < 0,05 соответственно) и с гиперплазией хрящевых клеток (для обеих популяций клеток).

Выводы

Исследуемые смеси вызывают поляризацию моноцитов в М1/M2 в зависимости от состава композиции. В этой связи их можно рекомендовать к использованию в косметологии и, возможно, в лечебной практике, в зависимости от этиологии заболевания и желаемого исхода.

Благодарности

Коллектив авторов выражает благодарность ректору Тюменского ГМУ И.М. Петрову, проректору по научно-исследовательской работе и инновационной политике Е.Б. Храмовой.