Изофлавоны красного клевера (Trifolium pratense) снижают окислительный стресс в селезенке и печени крыс с экспериментальным диабетом 2-го типа

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Сахарный диабет 2-го типа является хроническим заболеванием с множеством тяжелых осложнений. Число больных диабетом 2-го типа велико и продолжает нарастать по всему миру, что делает разработку новых средств лечения и профилактики данного заболевания крайне актуальной. Оксидативный стресс, вызванный гипергликемией, является одним из основных факторов поражения и дисфункции органов при сахарном диабете 2-го типа. Учитывая тесную вовлеченность иммунной системы в патогенез диабета и его осложнений, представляет интерес возможность влияния на активность системы антиоксидантной защиты в органах иммунопоэза, в частности в селезенке. Печень, интегрирующая все виды обмена веществ, наравне с органами иммунной системы как вносит вклад в патогенез диабета 2-го типа, так и является его мишенью. Красный клевер (Trifolium pratense) представляет интерес как дешевый и доступный источник антиоксидантов. Целью работы была оценка действия перорального введения водных экстрактов изофлавонов цветков красного клевера (Trifolium pratense) на состояние антиоксидантной системы защиты в крови, селезенке и печени крыс с экспериментальным диабетом. В течение месяца трижды в неделю половозрелым самцам крыс со стрептозотоцин-никотинамидной моделью сахарного диабета 2-го типа перорально вводили водные экстракты изофлавонов цветков красного клевера (Trifolium pratense), полученные методами «зеленых технологий» с использованием глубоких природных эвтектических растворителей, в дозах 300 мг/кг и 600 мг/кг. В крови было определено содержание глюкозы, относительное содержание гликированного гемоглобина, количество лейкоцитов разных фракций. Биохимически была определена активность ферментов системы антиоксидантной защиты каталазы и супероксиддисмутазы, содержание продукта перекисного окисления липидов малонового диальдегида и эндогенного антиоксиданта восстановленного глутатиона в крови и тканях селезенки и печени. Введение экстрактов изофлавонов цветков красного клевера (Trifolium pratense) снижало гипергликемию и восстанавливало количество моноцитов и гранулоцитов в крови, сниженное у крыс с диабетом; нормализовало активность каталазы в печени и активность супероксиддисмутазы в селезенке, уровень малонового диальдегида в селезенке и печени и содержание восстановленного глутатиона в селезенке, измененные у крыс с диабетом, до показателей здорового контроля, вне зависимости от дозы. Экстракты изофлавонов цветков красного клевера (Trifolium pratense) ослабляют гипергликемию и снижают окислительный стресс в органах крыс с экспериментальным СД2. Экстракты изофлавонов обладают иммунофармакологическим действием, проявляющемся в воздействии на показатели системы перекисного окисления липидов-антиоксидантной защиты в селезенке.

Полный текст

Введение

Сахарный диабет 2-го типа (СД2) – хроническое заболевание, характеризующееся гипергликемией и резистентностью к инсулину, которым в настоящее время страдает почти полмиллиона человек по всему миру. СД2 и его осложнения ощутимо снижают качество жизни и накладывают бремя на здравоохранение и социальную сферу [10], что обуславливает необходимость дальнейшего поиска веществ, способных облегчить гликемическую нагрузку и снизить скорость прогрессирования СД2. Согласно современным представлениям, окислительный стресс (ОС), т.е. дисбаланс между продукцией активных форм кислорода и неспособностью эндогенной антиоксидантной системы нейтрализовать их пагубное действие на клетки и ткани, вызванный гипергликемией, является одним из основных факторов патогенеза СД2, развития его сосудистых осложнений [6], повреждения и дисфункции органов [7]. Таким образом, смягчение ОС в органах является желанным следствием профилактики и терапии СД2.

Развитие представлений о роли иммунной системы в патогенезе СД2 закономерно обращает внимание исследователей на органы иммунопоэза, в частности, на селезенку. Исследователи отмечают, что, с одной стороны, гипергликемия оказывает значительное воздействие на селезенку [12], что может выражаться в формировании иммунологической недостаточности, а с другой стороны, отмечают важную роль этого органа в развитии эндокринных заболеваний [8, 9]. Ранее нами было показано, что селезенка подвержена воздействию ОС при экспериментальном СД2 в большей степени, чем печень [3]. Между тем ОС в печени также влияет на развитие осложнений СД2 [1]. Не смотря на важность изучения возможностей ослабления оксидативного стресса в селезенке и печени при СД2, экспериментальных работ, раскрывающих данный вопрос, крайне мало.

Красный клевер (Trifolium pratense) широко используется в качестве источника изофлавонов (ИФ), обладающих антиоксидантными свойствами [5]. Однако особенности его действия на систему ПОЛ-АОЗ в разных органах не изучены.

Целью работы было оценить действие ИФ цветков красного клевера (Trifolium pratense) на состояние антиоксидантной системы защиты в крови, селезенке и печени крыс с экспериментальным СД2.

Материалы и методы

Исследование проведено на 43 белых крысах-самцах Wistar массой 353,7±5,77 грамма возрастом 12-13 недель, содержавшихся в виварии на стандартном рационе для лабораторных животных DeltaFeeds (АО «БиоПро», Россия) с неограниченным доступом к чистой питьевой воде. На проведение эксперимента на животных было получено разрешение этического комитета ИИФ УрО РАН № 10/23 от 09.10.2023, все манипуляции с ними проводились в соответствии с рекомендациями международных этических комитетов и Директивой Совета ЕС 2010/63/EU.

Были сформированы следующие группы животных: 1) крысы с экспериментальным СД2; 2) крысы с экспериментальным СД2, получавшие экстракт ИФ в дозе 300 мг/кг массы тела (СД2 + ИФ 300); 3) крысы с экспериментальным СД2, получавшие экстракт ИФ в дозе 600 мг/кг массы тела (СД2 + ИФ 600); 4) здоровые крысы, получавшие экстракт ИФ в дозе 300 мг/кг (ИФ300); 5) здоровые крысы, получавшие экстракт ИФ в дозе 600 мг/кг (ИФ600); 6) здоровый контроль.

ИФ цветков красного клевера (Trifolium pratense) животные получали в виде водной суспензии перорально через зонд в дозах 300 и 600 мг/кг соответственно. Введение ИФ проводилось 3 раза в неделю на протяжении месяца (всего 12 доз). Экстракты ИФ были получены на базе Химико-технологического института Уральского федерального университета [4]. Контрольным животным из групп 1 и 6 вместо ИФ аналогичным образом вводили воду.

Для моделирования СД2 крысам производили в/б инъекции никотинамида (MilliporeSigma, США), растворенного в воде для инъекций, в дозе 110 мг/кг массы тела, а через 15 минут – стрептозотоцина (MilliporeSigma, США), растворенного в цитратном буфере (рН 4,5), в дозе 65 мг/кг (авторская модификация модели [11]). Крыс выводили из эксперимента декапитацией под изофлурановым (Laboratories Karizoo, S.A., Испания) наркозом, предварительно взяв кровь из хвостовой вены, извлекали селезенку и печень.

Показатели ОС определяли в тканях селезенки и печени (методика описана в [3], а также в крови (активность САТ (КФ 1.11.1.6) и СОД (КФ 1.15.1.1) – в эритроцитах, уровень МДА и содержание GSH – в цельной крови) (методика описана в [2]. Количество лейкоцитов в крови определяли при помощи гематологического анализатора Mindray BC-2800 Vet (Mindray, Китай). Концентрацию глюкозы в крови определяли натощак (fasting blood glucose, FBG) в плазме глюкозооксидазным методом с использованием набора реагентов «Глюкоза-Ново» (АО «Вектор-Бест», г. Новосибирск)). Относительное содержание гликированного гемоглобина (HbA1c) в цельной крови определяли методом аффинной гель-хроматографии с использованием набора реактивов ГЛИКОГЕМОТЕСТ (ЭЛТА, Москва, Россия). Измерение оптической плотности в ходе проведения биохимических исследований проводилось на спектрофотометре DU-800 (Beckman Coulter, США). При проведении работ было использовано оборудование Центра коллективного пользования ИИФ УрО РАН (ЦКП ИИФ УрО РАН).

Статистический анализ данных проводили с помощью программы OriginPro 9.0 (OriginLab Corporation, США). Значимость различий между группами оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни, критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Введение ИФ приводило к снижению уровня FBG независимо от дозы, достоверное снижение HbA1c наблюдалось после курса ИФ в дозе 600 мг/кг (рис. 1А, Б).

У крыс с экспериментальным СД2 наблюдалась тенденция к снижению количества лейкоцитов в крови (рис. 1В-Е), что можно объяснить иммунологической недостаточностью, развивающейся вследствие дисфункции селезенки в условиях ОС при СД2. Введение ИФ в обеих исследуемых дозах восстанавливало количество моноцитов и гранулоцитов в крови (рис. 1Д, Е).

 

Рисунок 1. Влияние изофлавонов красного клевера (Trifolium pratense) на показатели крови у крыс с экспериментальным СД2, M±m, значение каждого животного показано отдельной точкой

Примечание. СД2 – экспериментальный сахарный диабет 2-го типа; ИФ – изофлавоны; ИФ300 и ИФ600 – дозы ИФ 300 и 600 мг/кг соответственно; FBG (fasting blood glucose) – концентрация глюкозы в крови натощак; WBC (white blood cell) – лейкоциты. * – р < 0,05 в сравнении с контрольной группой здоровых животных; ** – р < 0,05 в сравнении с контрольной группой животных с СД2. Красным овалом отмечено отличие показателя от здорового контроля, зеленым – отличие от СД2 при приеме ИФ.

Figure 1. Effect of red clover (Trifolium pratense) isoflavones on the blood parameters in rats with experimental T2D, M±m, the value of each animal is shown as a separate point

Note. T2D, experimental diabetes type 2; IF, isoflavones; IF300 and IF600, doses of IF of 300 and 600 mg/kg, respectively; FBG (fasting blood glucose), fasting blood glucose concentration; WBC (white blood cell), leukocytes. *, p < 0.05 in comparison with the control group of healthy animals; **, p < 0.05 in comparison with the control group of animals with T2D. The red oval marks the difference from the healthy control, the green one shows the difference between T2D and T2D + IF.

 

Для исследования показателей ПОЛ-АОЗ в тканях были выбраны селезенка – орган иммунной системы, и печень – орган, интегрирующий обмен белков, липидов, углеводов и ответственный за обезвреживание эндогенных и экзогенных токсикантов. У крыс с экспериментальным СД2 содержание МДА возрастало во всех 3 исследованных биологических материалах – в крови, печени и селезенке (рис. 2Ж-И). В селезенке увеличивалась активность СОД (рис. 2Д) и снижался уровень GSH (рис. 2Л), в печени снижалась активность CAT (рис. 2В) и увеличивалось содержание GSH (рис. 2М).

Введение ИФ животным с СД2 нормализовало активность САТ в печени (рис. 2В), активность СОД в селезенке (рис. 2В, Д) уровень МДА в селезенке и печени (рис. 2З, И), содержание GSH в селезенке (рис. 2Л) до показателей здорового контроля вне зависимости от вводимой дозы.

 

Рисунок 2. Влияние изофлавонов красного клевера (Trifolium pratense) на показатели системы ПОЛ-АОЗ в крови и органах у крыс с экспериментальным СД2

Примечание. СД2 – экспериментальный сахарный диабет 2-го типа; ИФ – изофлавоны; ИФ300 и ИФ600 – дозы ИФ 300 и 600 мг/кг соответственно; CAT – активность каталазы; СОД – активность супероксиддисмутазы; MDA – уровень малонового диальдегида; GSH – содержание восстановленного глутатиона. * – р < 0,05 в сравнении с контрольной группой здоровых животных; ** – р < 0,05 в сравнении с группой животных с СД2; *** – р < 0,05 в сравнении с группой животных СД2 + ИФ600. Красным овалом отмечено отличие показателя от здорового контроля, зеленым – отличие от СД2 при приеме ИФ, синим – отличие между животными с СД2, получавшими разные дозы ИФ.

Figure 2. Effect of red clover (Trifolium pratense) isoflavones on the LPO-AOD system parameters in the blood and organs of rats with experimental T2D

Note. T2D, experimental diabetes type 2; IF, isoflavones; IF300 and IF600, doses of IF of 300 and 600 mg/kg, respectively; CAT, catalase activity; SOD, superoxide dismutase activity; MDA, malondialdehyde level; GSH, reduced glutathione content. *, p < 0.05 compared to the control group of healthy animals; **, p < 0.05 in comparison with the control group of animals with T2D; ***, p < 0.05 compared to animals with T2D + IF600. The red oval shows the difference from the healthy control, the green one shows the difference between T2D and T2D + IF, and the blue one shows the difference between animals with T2D that received different doses of IF.

 

Кроме того, при введении здоровым животным ИФ в дозе 300 мг/кг отмечено снижение уровня GSH в селезенке по сравнению с показателями контрольных животных. Напротив, в печени мы наблюдаем тенденцию к увеличению содержания GSH во всех экспериментальных группах (рис. 2М). Содержание GSH в органе является результатом соотношения скорости процессов его синтеза и расходования, которые, в свою очередь, зависят от количества продуктов перекисного окисления, образующихся под действием стресса. Печень является основным местом продукции GSH в организме и его количество в печени отражает потребности в глутатионе всего организма, что, вероятно, обуславливает высокое содержание GSH в печени при любой стрессовой ситуации, будь то развитие СД2 или манипуляции, связанные с пероральным введением ИФ.

Отдельно стоит отметить, что различный эффект от введения ИФ в разных дозах наблюдался при оценке активности САТ и СОД в эритроцитах, при этом активность ферментов у крыс с СД2 при введении дозы 600 мг/кг была на уровне здорового контроля.

Практической ценностью работы являются новые экспериментальные данные, характеризующие состояние системы перекисного окисления липидов-антиоксидантной защиты в селезенке и печени при введении экстрактов ИФ цветков красного клевера (Trifolium pratense) крысам с экспериментальным диабетом 2-го типа, а также демонстрация иммунофармакологического действия данных экстрактов, заключающегося в ослаблении оксидативного стресса в селезенке в модели диабета 2-го типа.

Выводы

  1. Экспериментальный СД2 способствует развитию ОС в тканях селезенки и печени.
  2. Экстракты ИФ цветков красного клевера (Trifolium pratense) способствуют ослаблению оксидативного стресса в селезенке и печени, снижению гликемии и восстановлению числа моноцитов и гранулоцитов в крови.
  3. Влияние экстрактов ИФ красного клевера (Trifolium pratense) на активность ферментов АОЗ СОД и каталазы в крови отличается в зависимости от вводимой дозы, введение в дозе 600 мг/кг нормализует активность данных ферментов, при введении в дозе 300 мг/кг этого не наблюдается.
×

Об авторах

Ксения Викторовна Соколова

ФГАОУ ВО «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина»; ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: xenia.socolova@gmail.com

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории морфологии и биохимии, лаборант кафедры медицинской биохимии и биофизики Института естественных наук и математики

Россия, г. Екатеринбург; г. Екатеринбург

Д. А. Туканов

ФГАОУ ВО «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина»; ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» Уральского отделения Российской академии наук

Email: xenia.socolova@gmail.com

аспирант, лаборант-исследователь лаборатории функционального дизайна нанокластерных полиоксиметаллатов Института естественных наук

Россия, г. Екатеринбург; г. Екатеринбург

Список литературы

  1. Вольхина И.В., Бутолин Е.Г. Оксидативный стресс и изменения показателей обмена сиалогликоконъюгатов печени крыс с аллоксановым сахарным диабетом // Сахарный диабет, 2022. Т. 25, № 3. С. 249-255. [Volkhina I.V., Butolin E.G. Oxidative stress and changes in liver sialoglycoconjugate metabolic parameters in rats with alloxanic diabetes mellitus. Sakharnyy diabet = Diabetes Mellitus, 2022, Vol. 25, no. 3, pp. 249-255. (In Russ.)]
  2. Емельянов В.В., Гетте И.Ф., Данилова И.Г., Сидорова Л.П., Цейтлер Т.А., Мухлынина Е.А. Влияние соединения класса 1,3,4-тиадиазинов на выраженность окислительного стресса при экспериментальном сахарном диабете 2 типа // Химико-фармацевтический журнал, 2023. Т. 57, № 3. С. 20-24. [Emelianov V.V., Gette I.F., Danilova I.G., Sidorova L.P., Zeitler T.A., Mukhlynina E.A. Effect of 1,3,4-thiadiazine class compounds on the severity of oxidative stress in experimental type 2 diabetes mellitus. Khimiko-farmatsevticheskiy zhurnal = Chemical and Pharmaceutical Journal, 2023, Vol. 57, no. 3. pp. 20-24. (In Russ.)]
  3. Соколова К.В., Гетте И.Ф., Туканов Д.А., Данилова И.Г. Особенности оксидативного стресса в печени и селезенке крыс при экспериментальном сахарном диабете 2 типа // Вестник уральской медицинской академической науки, 2024. Т. 21, № 5. С. 565-573. [Sokolova K.V., Gette I.F., Tukanov D.A., Danilova I.G. Peculiarities of oxidative stress in the liver and spleen of rats with experimental type 2 diabetes mellitus. [Online] Vestnik uralskoy meditsinskoy akademicheskoy nauki = Journal of Ural Medical Academic Science, 2024, Vol. 21, no. 5, pp. 565-573. (In Russ.)]
  4. Aboushanab S.A., Shevyrin V.A., Melekhin V.V., Andreeva E.I., Makeev O.G., Kovaleva E.G. Cytotoxic Activity and Phytochemical Screening of Eco-Friendly Extracted Flavonoids from Pueraria montana var. lobata (Willd.) Sanjappa & Pradeep and Trifolium pratense L. Flowers Using HPLC-DAD-MS/HRMS. AppliedChem, 2023, Vol. 3, no. 1, pp. 119-140.
  5. Akbaribazm M., Khazaei M.R., Khazaei M. Phytochemicals and antioxidant activity of alcoholic/hydroalcoholic extract of Trifolium pratense. Chin. Herb. Med., 2020, Vol. 12, iss. 3, pp. 326-335.
  6. Bhatti J.S., Sehrawat A., Mishra J., Sidhu I.S., Navik U., Khullar N., Kumar S., Bhatti G.K., Reddy P.H. Oxidative stress in the pathophysiology of type 2 diabetes and related complications: Current therapeutics strategies and future perspectives. Free Radic. Biol. Med., 2022, Vol. 184, pp. 114-134.
  7. Caturano A., D’Angelo M., Mormone A., Russo V., Mollica M.P., Salvatore T., Galiero R., Rinaldi L., Vetrano E., Marfella R., Monda M., Giordano A., Sasso F.C. Oxidative Stress in Type 2 Diabetes: Impacts from Pathogenesis to Lifestyle Modifications. Curr. Issues Mol. Biol., 2023, Vol. 45, no. 8, pp. 6651-6666.
  8. Dias H.F., Fu J.F., Luck T.G., Wolfe G.E., Hostetter E.R., Ng N.C., Zheng H., Kühtreiber W.M., Price J.C., Catana C., Faustman D.L. The spleen assumes a major role in blood glucose regulation in type 1 diabetes patients treated with BCG. Sci. Rep., 2024, Vol. 14, no. 1, 17611. doi: 10.1038/s41598-024-67905-x.
  9. Hanchang W., Wongmanee N., Yoopum S., Rojanaverawong W. Protective role of hesperidin against diabetes induced spleen damage: Mechanism associated with oxidative stress and inflammation. J. Food Biochem., 2022, Vol. 46, no. 12, e14444. doi: 10.1111/jfbc.14444.
  10. Janssen L.M.M., Hiligsmann M., Elissen A.M.J., Joore M.A., Schaper N.C., Bosma J.H.A., Stehouwer C.D.A., Sep S.J.S., Koster A., Schram M.T., Evers S.M.A.A. Burden of disease of type 2 diabetes mellitus: cost of illness and quality of life estimated using the Maastricht Study. Diabet Med., 2020, Vol. 37, no. 10, pp. 1759-1765.
  11. Masiello P., Broca C., Gross R., Roye M., Manteghetti M., Hillaire-Buys D., Novelli M., Ribes G. Experimental NIDDM: development of a new model in adult rats administered streptozotocin and nicotinamide. Diabetes, 1998, Vol. 47, no. 2, pp. 224-229.
  12. Mora-Ortiz M., Nuñez Ramos P., Oregioni A., Claus S.P. NMR metabolomics identifies over 60 biomarkers associated with Type II Diabetes impairment in db/db mice. Metabolomics, 2019, Vol. 15, no. 6, 89. doi: 10.1007/s11306-019-1548-8.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Влияние изофлавонов красного клевера (Trifolium pratense) на показатели крови у крыс с экспериментальным СД2, M±m, значение каждого животного показано отдельной точкой Примечание. СД2 – экспериментальный сахарный диабет 2-го типа; ИФ – изофлавоны; ИФ300 и ИФ600 – дозы ИФ 300 и 600 мг/кг соответственно; FBG (fasting blood glucose) – концентрация глюкозы в крови натощак; WBC (white blood cell) – лейкоциты. * – р < 0,05 в сравнении с контрольной группой здоровых животных; ** – р < 0,05 в сравнении с контрольной группой животных с СД2. Красным овалом отмечено отличие показателя от здорового контроля, зеленым – отличие от СД2 при приеме ИФ.

Скачать (1MB)
Метаданные
3. Рисунок 2. Влияние изофлавонов красного клевера (Trifolium pratense) на показатели системы ПОЛ-АОЗ в крови и органах у крыс с экспериментальным СД2 Примечание. СД2 – экспериментальный сахарный диабет 2-го типа; ИФ – изофлавоны; ИФ300 и ИФ600 – дозы ИФ 300 и 600 мг/кг соответственно; CAT – активность каталазы; СОД – активность супероксиддисмутазы; MDA – уровень малонового диальдегида; GSH – содержание восстановленного глутатиона. * – р < 0,05 в сравнении с контрольной группой здоровых животных; ** – р < 0,05 в сравнении с группой животных с СД2; *** – р < 0,05 в сравнении с группой животных СД2 + ИФ600. Красным овалом отмечено отличие показателя от здорового контроля, зеленым – отличие от СД2 при приеме ИФ, синим – отличие между животными с СД2, получавшими разные дозы ИФ.

Скачать (1MB)
Метаданные

© Соколова К.В., Туканов Д.А., 2025

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах