СВЕРХЭКСПРЕССИЯ PPM1D ПРИВОДИТ К ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНОМУ ЦИТОКИНОВОМУ ПРОФИЛЮ В ОТВЕТ НА АКТИВАЦИЮ NF-κB В КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА ЧЕЛОВЕКА

Резюме

Протеинфосфатаза PPM1D (Protein phosphatase, Mg²⁺/Mn²⁺ dependent, 1D) является одним из ключевых регуляторов реакции на стресс, вызванной повреждением ДНК, клеточного цикла и апоптоза. Сверхэкспрессию PPM1D обнаруживают в большом количестве типов как солидных (рак легких, рак молочной железы и т.д.), так и гематологических (острый миелоидный лейкоз) злокачественных новообразований, что делает PPM1D важным прогностическим маркером при онкологиях. Особе внимание стоит уделить сверхэкспрессии PPM1D в колоректальном раке (КРР), являющимся третьим по распространённости среди всех онкологических заболеваний, потому что данный показатель коррелирует с увеличением размера опухоли, метастазированием, неблагоприятным прогнозом выживаемости и развитием лекарственной устойчивости. При этом лекарственная резистентность может быть связана с тем, что PPM1D напрямую дефосфорилирует р53 и другие компоненты сигнальнго пути ATM-p53, а также выступает в роли негативного регулятора NF-κB. Вероятно, что сверхэкспрессия PPM1D в опухолевых клетках КРР может приводить к снижению синтеза важных провоспалительных цитокинов и развитию иммуносупрессивного окружения опухоли, что может значительно ухудшать исход терапии. На данный момент роль PPM1D в регуляции воспалительного ответа в КРР остается недостаточно изученной. Целью данного исследования является сравнение эффекта химического ингибирования PPM1D путем использования его селективного ингибитора GSK2830371 и генетического нокаута PPM1D на линии колоректального рака человека HT-29 в условиях индукции сигнального пути NF-κB при обработке TNF.

В данной работе была использована клеточная линия колоректального рака человека HT-29, а также ранее полученные линии HT-29 с нокаутом и с повышенной экспрессией гена PPM1D. Клетки культивировали в стандартных условиях. Для проведения экспериментов использовали TNF в концентрации 20 нг/мл и GSK2830371 в концентрации 10 мкМ. Инкубирование клеток с GSK2830371 производили в течение суток и с TNF в течение 12 часов. Измерение продукции цитокинов оценивали при помощи мультиплексной технологии xMAP INTELLIFLEX, а измерение экспрессии генов оценивали методом ПЦР в реальном времени.

При мультиплексной оценке уровня секреции цитокинов было обнаружено, что ни инкубация клеток с GSK2830371, ни нокаут PPM1D не приводят к изменениям в цитокиновом профиле без стимуляции по сравнению с интактной клеточной линией. В случае стимуляции пути NF-κB с помощью TNF и ингибировании PPM1D также не выявлено значительного увеличения продукции провоспалительных цитокинов и факторов роста. А при оценке клеточной линии HT-29 со сверхэкспрессией PPM1D при помощи ПЦР в реальном времени наблюдалось статистически значимое увеличение уровня экспрессии TNF, IL-8 и IL-1b в ответ на обработку TNF по сравнению с линией дикого типа, что не согласуется с данными о негативной регуляции пути NF-κB фосфатазой PPM1D.

В результате работы показано, что нокаут гена PPM1D существенно не влиял на уровень цитокинов (IL-8, GM-CSF и др.), находящихся под контролем транскрипционного фактора NF-κB в случае индукции TNF, в сравнении с использованием селективного ингибитора GSK2830371. При этом повышенная экспрессия PPM1D приводила к увеличению экспрессии генов провоспалительных цитокинов, таких как IL-8, TNF, IL-1b, при индукции пути NF-κB с помощью TNF.