PPM1D overexpression is associated with proinflammatory cytokine profile in response to NF-κB activation in human colorectal cancer cell line

Full Text

Введение

Протеинфосфатаза PPM1D (Protein phosphatase, Mg²⁺/Mn²⁺ dependent, 1D) участвует в большом количестве физиологически важных процессов клетки, таких как реакция на стресс, вызванная повреждением ДНК, регуляция клеточного цикла, клеточная гибель и т.д. [8]. На сегодняшний день показано, что PPM1D может выступать в роли протоонкогена [6]. Сверхэкпрессию PPM1D обнаруживают при нейробластоме, раке поджелудочной железы, легких, молочной железы, мочевого пузыря и т.д. [6]. Также, PPM1D сверхэкспрессируется в 60-80% случаев колоректального рака (КРР) [5, 6, 8]. При этом повышенная экспрессия PPM1D положительно коррелирует с размером опухоли и с отдельными метастазами, в том числе в лимфатические узлы [5]. Помимо этого, пациенты с повышенной экспрессией PPM1D имеют плохой прогноз выживаемости и резистентность к терапии, что делает PPM1D важным прогностическим маркером для КРР [5, 6].

КРР занимает третье место по распространенности среди всех видов рака, кроме того, у порядка 90% пациентов с метастазами наблюдается низкий эффект от противоопухолевой терапии, что связано в основном с приобретенной лекарственной резистентностью [4]. Одну из ключевых ролей в развитии резистентности КРР к применяемым препаратам может играть ген PPM1D, так как он способен напрямую дефосфорилировать р53, основной регулятор клеточного цикла и важный компонент пути апоптоза, а также другие белки пути ATM-p53 [3, 7]. Важно отметить, что PPM1D также является негативным регулятором NF-κB [1]. Ингибирование NF-κB через PPM1D происходит как p38-зависимым, так и независимым образом [1]. Вероятно, что сверхэкспрессия PPM1D в опухолевых клетках может приводить к снижению синтеза важных провоспалительных цитокинов и развитию иммуносупрессивного окружения опухоли, что может значительно ухудшать исход терапии.

Отдельно стоит отметить перспективный таргетный препарат GSK2830371, который является высокоселективным ингибитором PPM1D, связывающимся с уникальным субдоменом, расположенным рядом с каталитическим сайтом PPM1D [2]. Обработка раковых клеток GSK2830371 увеличивает фосфорилирование субстратов PPM1D и вызывает р53-зависимое ингибирование роста клеток различных типов рака, например, в линиях гемопоэтических опухолевых клеток и в клетках опухоли молочной железы, несущих TP53 дикого типа [2].

В нашей работе мы оценили цитокиновый профиль клеток КРР человека с нокаутом и со сверхэкспрессией гена PPM1D как в интактном состоянии, так и в случае активации пути NF-κB с помощью TNF.

Материалы и методы

Клеточные линии

В экспериментах использовали клеточную линию КРР человека HT-29 (Kerafast, США). Также, в работе были использованы ранее полученные линия HT-29 с нокаутом гена PPM1D и линия HT-29 с повышенной экспрессией PPM1D.

Клеточные линии культивировали в культуральной среде DMEM (Servicebio, Китай), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Сytiva, США), 150 мг L-глутамина (Thermo Fisher, США) и 10 мг пенициллина и стрептомицина (Servicebio, Китай). Клетки культивировали в пластиковых фласках с адгезионным покрытием (Eppendorf, Германия) в CO₂-инкубаторе (Binder, Германия) в атмосфере 5% CO₂ и при температуре 37 °С.

Измерение продукции цитокинов

Анализ продукции цитокинов в культуральной среде от клеточных линий проводили с использованием мультиплексной технологии xMAP INTELLIFLEX (Luminex, США) и набора MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel (Merck, США) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Для нормализации полученных данных был использован Z-score анализ.

Измерение экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК выделяли из клеток при помощи реагента ExtractRNA (Евроген, Россия) в соответствии со стандартным протоколом производителя. Одноцепочечную комплементарную ДНК (кДНК) получали путем обратной транскрипции 1000 нг РНК с использованием набора RT-PCR MINT (Евроген, Россия). ПЦР в реальном времени проводили с помощью реагента 5X qPCRmix-HS SYBR + LowROX (Евроген, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Данные нормировали на экспрессию гена домашнего хозяйства GAPDH. Режим амплификации был одинаков для всех праймеров: 95 °C 5 минут, 40 циклов 95 °C 15 секунд и 60 °C 60 секунд. Каждый образец анализировали в трех технических повторностях. Экспрессию генов анализировали методом 2^-ΔΔCt. Последовательности праймеров для гена GAPDH (прямой: GTCTCCTCTGACTTCACCAGCG, обратный: ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA), для гена TNF (прямой: CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG, обратный: ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC), для гена IL-8 (прямой: GTTTTTGAAGAGGGCTGAGAATTC, обратный: ATGAAGTGTTGAAGTAGATTTGCTTG) и для гена IL-1b (прямой: AGCTACGAATCTCCGACCAC, обратный: CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA).

Статистический анализ

Для статистической обработки данных использовали программу GraphPad Prism 9.5. Экспериментальные данные анализировали при помощи теста One-way ANOVA. Различия считали достоверными при * – p < 0,05, ** – p < 0,01, *** – p < 0,001, **** – p < 0,0001, ns (non-significant) – нет разницы.

Результаты и обсуждение

Предыдущие исследования показали, что PPM1D является негативным регулятором пути NF-κB и нокаут данного гена приводит к увеличению воспалительного ответа [1]. В рамках нашего исследования мы провели сравнительный анализ химического ингибирования PPM1D посредством селективного ингибитора GSK2830371 и генетического нокаута PPM1D на линии КРР человека HT-29 в условиях индукции сигнального пути NF-κB при обработке TNF. По результатам мультиплексного анализа цитокинов было обнаружено, что ни инкубация клеток с GSK2830371, ни нокаут PPM1D не приводят к изменениям в цитокиновом профиле без стимуляции по сравнению с интактной клеточной линией (рис. 1А). Предполагалось, что нокаут PPM1D или инкубация с GSK2830371 приведет к увеличению секреции TNF-индуцированных воспалительных цитокинов. Однако общая тенденция показывает, что нокаут PPM1D и использование химического ингибитора GSK2830371 не приводят к значительному увеличению продукции провоспалительных цитокинов и факторов роста (рис. 1А). Ранее J. Chew и соавт. показали, что нокаут PPM1D в клеточной линии HeLa приводит к увеличению экспрессии TNF и IL-8 в ответ на IL-1 [1]. В данном случае ни нокаут PPM1D, ни ингибирование с помощью GSK2830371 не приводили к увеличению секреции IL-8 в ответ на TNF (рис. 1Б).

 

Рисунок 1. Уровень концентрации цитокинов в культуральной среде от клеточных линий HT-29 дикого типа и с нокаутом PPM1D при нормальных условиях, при ингибировании GSK2830371 и при их индукции TNF

Примечание. А – относительная экспрессия различных цитокинов и факторов роста в клеточной линии HT-29 дикого типа (HT-29 wt) при инкубации с TNF (20 нг/мл) и с инкубацией с селективным ингибитором PPM1D GSK2830371 (10 мкМ) и относительная экспрессия различных цитокинов и факторов роста клеточной линии HT-29 с нокаутом гена PPM1D (HT-29 PPM1DKo) при инкубации с TNF (20 нг/мл). Инкубацию с GSK2830371 производили в течение суток. Инкубирование клеток с TNF производили в течение 12 часов. Данные нормализованы и представлены в виде Z-оценок. Б – концентрация цитокина IL-8 (пг/мл). Статистический анализ проведен с помощью One-way ANOVA теста; * – p < 0,05, **** – p < 0,0001, ns (non-significant) – нет разницы.

Figure 1. Cytokine concentration levels in culture medium from wild-type and PPM1D knockout HT-29 cell lines under normal conditions, upon inhibition with GSK2830371, and upon their induction by TNF

Note. A, relative expression of various cytokines and growth factors in the wild-type HT-29 cell line (HT-29 wt) during incubation with TNF (20 ng/ mL) and with the selective PPM1D inhibitor GSK2830371 (10 μM), and relative expression of various cytokines and growth factors in the PPM1D gene knockout HT-29 cell line (HT-29 PPM1DKo) during incubation with TNF (20 ng/mL). Incubation with GSK2830371 was performed for 24 hours. Incubation of cells with TNF was carried out for 12 hours. Data are normalized and presented as Z-scores. B, IL-8 cytokine concentration (pg/mL). Statistical analysis was performed using the One-way ANOVA test; *, p < 0.05, ****, p < 0.0001, ns (non-significant) – no difference.

 

Показано, что NF-κB является активатором транскрипции в том числе и PPM1D, что создает петлю негативной обратной связи, так как PPM1D дефосфорилирует NF-κB (рис. 2А) [1]. При этом опухоли КРР часто сверхэкспрессируют PPM1D [5, 6]. Была проведена оценка экспрессии генов провоспалительных цитокинов под контролем транскрипционного фактора NF-κB методом ПЦР в реальном времени на линиях HT-29 дикого типа и со сверхэкспрессией PPM1D. Данные линии инкубировались с TNF в концентрации 20 нг/мл в течение 3 часов. Было обнаружено, что в клеточной линии HT-29 со сверхэкспрессией происходит значительное увеличение уровня экспрессии таких цитокинов, как TNF, IL-8 и IL-1b, по сравнению с линией HT-29 дикого типа в ответ на обработку TNF (рис. 2Б). Однако это не согласуется с данными о том, что PPM1D является негативным регулятором пути NF-κB [1]. При этом H. Zhong и соавт. показали, что повышение уровня экспрессии PPM1D в случае нейровоспаления ретинальных астроцитов наблюдается совместно с увеличением экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов (TNF, IL-8, IL-6, IL-1b) [9]. Данные литературы противоречивы, и наша работа подчеркивает, что PPM1D может оказывать различное влияние на сигнальный путь NF-κB, что требует дальнейшего изучения. Особенно актуальным это является в опухолевых моделях КРР, где высокий процент пациентов с сверхэкспрессией PPM1D. При этом стоит отметить, что такой эффект может быть обусловлен генетической нестабильностью в опухолевых клеточных линиях, где сверхэкспрессия или нокаут одного гена могут приводить к компенсаторным механизмам.

 

Рисунок 2. Относительный уровень экспрессии TNF, IL-8 и IL-1b в клетках HT-29 дикого типа и со сверхэкспрессией PPM1D

Примечание. А – схема негативной обратной связи NF-κB и PPM1D (схема адаптирована из [7]). Б – относительный уровень экспрессии TNF, IL-8 и IL-1b, нормированные по гену домашнего хозяйства GAPDH, у линии HT-29 дикого типа (HT-29 wt) и у линии HT-29 со сверхэкспрессией PPM1D (HT-29 PPM1D). Инкубация с TNF (20 нг/мл) проводили в течение 3 часов. Статистический анализ проведен с помощью One-way ANOVA теста; * – p < 0,05, **** – p < 0,0001, ns (non-significant) – нет разницы.

Figure 2. Relative expression levels of TNF, IL-8 and IL-1b in wild-type and PPM1D-overexpressing HT-29 cells

Note. A, negative regulation of NF-κB and PPM1D (adapted from [7]). B, relative expression levels of TNF, IL-8 and IL-1b normalized to the housekeeping gene GAPDH in wild-type HT-29 (HT-29 wt) and PPM1D-overexpressing HT-29 (HT-29 PPM1D) cells. Incubation with TNF (20 ng/mL) was performed for 3 hours. Statistical analysis was performed using the One-way ANOVA test; *, p < 0.05, ****, p < 0.0001, ns (non-significant) – no difference.

 

Выводы

В результате работы показано, что нокаут гена PPM1D существенно не влиял на уровень цитокинов (IL-8, GM-CSF и др.), находящихся под контролем транскрипционного фактора NF-κB в случае индукции TNF, в сравнении с использованием селективного ингибитора GSK2830371. При этом повышенная экспрессия PPM1D приводила к увеличению экспрессии генов провоспалительных цитокинов, таких как IL-8, TNF, IL-1b, при индукции пути NF-κB с помощью TNF.

Это исследование выявило парадоксальную роль PPM1D в регуляции пути NF-κB в линии КРР человека. Данные, полученные на клеточной линии НТ-29, противоречащие результатам, опубликованным на других клеточных линиях, могут объясняться отличным паттерном экспрессии других фосфатаз семейства PP2C, к которому принадлежит данная фосфатаза, в HT-29 [1, 9]. Обнаруженный фенотип может приводить к иммуномодуляции в онкогенезе КРР и требует дальнейшего изучения. Хроническое воспаление провоцирует малигнизацию опухоли, при этом применение химических ингибиторов PPM1D может нивелировать эти последствия.

Благодарности

Выражаем искреннюю благодарность Prof. D. Mannel (Tübingen) за любезно предоставленный рекомбинантный человеческий TNF. Также выражаем благодарность С.А. Недоспасову за ценные комментарии по тексту рукописи.

About the authors

E. D. Kolosova

Sirius University of Science and Technology; Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: kolosova.ed@talantiuspeh.ru

Laboratory Assistant; Laboratory Assistant

Russian Federation, Sirius, Krasnodar Region; Saint Petersburg

D. A. Lisitsa

Sirius University of Science and Technology

Email: kolosova.ed@talantiuspeh.ru

Laboratory Assistant

Russian Federation, Sirius, Krasnodar Region

O. N. Demidov

Sirius University of Science and Technology; Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences

Email: kolosova.ed@talantiuspeh.ru

PhD, MD (Medicine), Professor; Leading Researcher

Russian Federation, Sirius, Krasnodar Region; Saint Petersburg

D. A. Bogdanova

Sirius University of Science and Technology; Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences

Email: kolosova.ed@talantiuspeh.ru

Postgraduate Student, Junior Researcher; Junior Researcher

Russian Federation, Sirius, Krasnodar Region; Saint Petersburg

References

Supplementary files