Сравнительное исследование иммуномодулирующего влияния экстракта из голотурий и индукторов поляризации макрофагов на модели фагоцитов Eupentacta fraudatrix при ранении

Полный текст

Введение

Морские беспозвоночные животные голотурии (Holothuroidea, Echinodermatа) известны своей высокой способностью к регенерации утраченных частей тела и эффективному заживлению ран [5]. Ранее полученный из тканей голотурий дальневосточных видов экстракт (ЭГ) обладает выраженными бактерио- и фунгистатическими эффектами, а также способствует ускорению заживления ран [1]. Отмечены его иммуномодулирующие свойства на модели фагоцитов голотурий, являющихся аналогами макрофагов, in vitro [2]. В исследованиях на позвоночных животных установлена ведущая роль отдельных типов макрофагов (M1 или М2) в регуляции заживления на его разных стадиях [15]. М1- и М2-макрофаги имеют ряд фенотипических отличий, в частности М1-макрофаги несут поверхностные маркеры CD64 и CD80, а М2-макрофаги характеризуются наличием CD64 и CD209. Кроме того, в макрофагах М1 высок уровень продукции оксида азота (NO), а М2-клетки отличает высокая активность аргиназы. Макрофаги принимают тот или иной фенотип («поляризуются») под влиянием микроокружения. Для стимуляции их поляризации по М1-пути могут использоваться некоторые препараты. Такие цитокины, как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и фактор некроза опухолей α (TNFα) считаются индукторами поляризации по М1-типу [9]. В то же время есть данные о способности этих цитокинов стимулировать заживление ран [3].

Участие фагоцитов голотурий в заживлении ран было продемонстрировано ранее [13]. Вместе с тем, выделение обогащенных фракций фагоцитов, получивших название Ф1 и Ф2, которые имеют высокий уровень NO или высокую активность аргиназы соответственно [8], позволяет выделить среди фагоцитов голотурий две субпопуляции, подобные М1- и М2-макрофагам.

Было также показано, что количество Ф1- и Ф2-фагоцитов и их соотношение меняются в процессе заживления раны, что позволило предположить их различную роль [7]. Одним из факторов, затрудняющих дальнейшие исследования, является отсутствие у фагоцитов голотурий поверхностных маркеров, известных для позвоночных. Однако Ф1- и Ф2-фагоциты голотурий отличаются по уровню связывания их поверхностных рецепторов с растительными лектинами [6], что позволяет характеризовать различия в их фенотипе.

Механизмы влияния ЭГ на отдельные типы фагоцитов в процессе ранозаживления в модельных экспериментах оставались неизученными. Представляло интерес исследование влияния экстракта в сравнении с препаратами, известными как индукторы поляризации макрофагов.

Целью данной работы явилось изучение влияния ЭГ на численность и фенотип фагоцитов Ф1 и Ф2 при поверхностном ранении голотурии Eupentacta fraudatrix в сравнении с таковым GM- CSF и TNFα.

Материалы и методы

Экземпляры голотурии E. fraudatrix с длиной тела 4-6 см собирали в феврале-марте в зал. Восток (зал. Петра Великого, Японское море) легко-водолазным методом. ЭГ получали из тканей голотурий, собранных в б. Алексеева (зал. Петра Великого, Японское море), на МЭС ТОИ ДВО РАН «о. Попова», по методу, описанному ранее [1].

Поверхностный надрез производили скальпелем. Одновременно животным (n = 4-6) с помощью шприца вводили в целомическую полость фосфатно-солевой буфер с добавлением 36 г/л NaCl (ФСБН) или один или два препарата: GM-CSF (0,02 мкг/г, ГНЦ ИБХ РАН, Россия), TNFα (0,02 мкг/г, «Цитокин», Россия) и ЭГ(0,3 мкг/г). Кроме того, интактным животным инъецировали ФСБН (контроль) или другие препараты. Через 0 мин или 24 ч от начала эксперимента у животных отбирали целомическую жидкость (ЦЖ), из которой выделяли фагоциты двух типов центрифугированием в градиенте фиколл-верографина [6]. Определяли концентрацию клеток в камере Горяева. Окрашивание клеток ФИТЦ-мечеными лектинами (ICN Biomedicals, Eschwege, Germany) из Dolichos biflorus (DBA), Canavalia ensiformis (conA) и Glycin max (SBA), проводили по методу, описанному McKenzie, Preston [11]. Исследование флуоресценции конъюгатов проводили с использованием микроскопа Leica DM 4500 (Weltzlar, Германия). Измерение длины раны проводили немедленно и через 72 ч после нанесения раны. Различия между группами определяли методом одновариантного анализа (one-way ANOVA) с использованием t-критерия Стьюдента. Разницу между группами считали достоверной при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Ранение вызывало увеличение концентрации клеток в целомической жидкости через 1 сут. в 4,8 раза по сравнению с контролем (рис. 1А). Повышение уровня циркулирующих целомоцитов через 1 сут. после ранения голотурии было показано и ранее [7]; оно сопровождает падение количества клеток в первые часы после ранения и, по-видимому, связано с необходимостью пополнения пула клеток, рекрутируемых в ткани.

 

Рисунок 1. Концентрация клеток целомической жидкости при ранении и инъекции препаратов, M ± Σ

Примечание. А – целомоциты, 1 сут. 1 – ФСБН, 2 – ранение + ФСБН, 3 – GM-CSF, 4 – ранение + GM-CSF, 5 – ранение + TNFα, 6 – ЭГ, 7 – ранение + ЭГ, 8 – ранение + ЭГ + GM-CSF. По оси ординат-концентрация клеток, кл. × 10⁶/мл. Достоверность различий между контролем (ФСБН) и ранением (a) и между ранением и другими экспериментальными группами (b) соответствует p < 0,05. n = 6. Б и В – содержание фагоцитов Ф1 (Б) и Ф2 (В). 1 – ФСБН, 0 мин, 2 – ФСБН 1 сут., 3 – ранение + ФСБН 1 сут., 4 – GM-CSF 1 сут., 5 – ранение+GM-CSF 1 сут., 6 – ранение + TNFα, 1 сут., 7 – ранение + ЭГ 1 сут., 8 – ранение + ЭГ + GM-CSF 1 сут., 9 – ЭГ, 1 сут. По оси ординат-количество фагоцитов, кл. × 10⁶/экземпляр. Достоверность различий между контролем на 0 мин и группами на 1 сут. (a) и между контролем на 1 сут. и экспериментальными группами на 1 сут. (b), а также между ранением и другими экспериментальными группами (c) соответствует p < 0,05. n = 6.

Figure 1. Concentration of coelomic fluid cells during injury and drug injection, M ± Σ

Note. A, coelomocytes, 1 day. 1, bufferd saline, BSN; 2, injury + BSN; 3, GM-CSF; 4, injury + GM-CSF; 5, injury + TNFα; 6, EH; 7, injury + EH; 8, injury + EH + GM-CSF. The ordinate axis shows cell concentration, cells × 10⁶/mL. Note: the significance of differences between the control (BSN) and wound (a) and between wound and other experimental groups (b) corresponds to p < 0.05. n = 6. (B) and (C): Content of phagocytes P1 (B) and P2 (C). 1, BSN; 0 min; 2, BSN 1 day; 3, wound + BSN 1 day; 4, GM-CSF 1 day; 5, wound + GM-CSF 1 day; 6, wound + TNFα, 1 day; 7, wound + EH 1 day; 8, wound + EH + GM-CSF 1 day; 9, EH, 1 day. The ordinate axis shows the number of phagocytes, cells × 10⁶/specimen. Note: the significance of differences between the control at 0 min and the groups on day 1 (a) and between the control on day 1 and the experimental groups on day 1 (b), as well as between injury and other experimental groups (c) corresponds to p < 0.05. n = 6.

 

При этом GM-CSF и ЭГ также повышали концентрацию целомоцитов по сравнению с контролем, как у интактных, так и раненых животных, однако это повышение в последнем случае было ниже, чем при одном ранении. Введение TNFα раненым животным возвращало этот показатель к контрольным значениям. По-видимому, ЭГ и GM-CSF стимулируют рекрутирование целомоцитов в ткани, что снижает количество целомоцитов в ЦЖ. TNFα способен стимулировать рекрутирование целомоцитов при ранении в еще большей степени, чем GM-CSF и ЭГ. Совместное введение GM-CSF и ЭГ также предотвращало повышение концентрации целомоцитов при ранении.

Содержание фагоцитов Ф1 (рис. 1Б) и Ф2 (рис. 1В) было одинаковым в начальный момент (0 мин) после инъекции ФСБН. Но через сутки содежание Ф2-фагоцитов значительно превышало таковое Ф1-фагоцитов, что свидетельствует о преимущественном рекрутировании в ткани Ф1-фагоцитов. Как и в случае целомоцитов, ранение повышало содержание Ф1-фагоцитов в целомической жидкости по сравнению с контролем. ЭГ стимулировал рост содержания Ф1 при ранении по сравнению с одним ранением. Напротив, TNFα и GM-CSF снижали повышение содержания Ф1 при ранении, хотя GM-CSF повышал содержание этих клеток у интактных животных. По-видимому, цитокины увеличивают, а ЭГ подавляет рекрутирование этих клеток в ткани. Эффект одновременного введения GM-CSF и ЭГ на содержание Ф1-фагоцитов, как и в случае целомоцитов, демонстрирует наличие разных механизмов их действия на эти клетки.

Напротив, содержание Ф2-фагоцитов (рис. 1В) снижалось при ранении по сравнению с контролем через 1 сут. Действие TNFα было направлено на снижение рекрутирования Ф2-фагоцитов в ткани раненых животных. Ни ЭГ, ни GM-CSF, не влияли на содержание Ф2-фагоцитов при ранении, что свидетельствует о том, что их действие связано преимущественно с влиянием на Ф1-фагоциты. Соответственно, цитокины, по-видимому, вызывали сдвиг соотношения фагоцитов двух типов в тканях в сторону преобладания Ф1-фагоцитов, а ЭГ – Ф2-фагоцитов.

Свежевыделенные фагоциты Ф1 и Ф2 связывали сonА в одинаковой пропорции (табл. 1), при этом отмечена тенденция к более низкому связыванию DBA в Ф2-фагоцитах по сравнению с Ф1-клетками. Ранение вызывало в Ф1-фагоцитах достоверное увеличение связывания conA, но не DBA.

 

Таблица 1. Связывание растительных лектинов поверхностными рецепторами фагоцитов Ф1 и Ф2 через 1 сут. после ранения и инъекции препаратов, M ± Σ

Table 1. Binding of plant lectins to surface receptors of phagocytes P1 and P2 1 day after injury and injection of preparations, M ± Σ

Тип воздействия Group	Лектины, % связывания Lectins, % of binding
	Con A		DBA
	Ф1 P1	Ф2 P2	Ф1 P1	Ф2 P2
Контроль Control	16,9 ± 6,8	18,1 ± 1,8	25,9 ± 3,4	31,7 ± 5,4
Рана Wound	40,9 ± 5,6*	22,4 ± 3,5	23,9 ± 8,2	22,3 ± 5,1
Рана + GM-CSF Wound + GM-CSF	28,1 ± 11,1	22,4 ± 3,4	10,5 ± 2,3*	13,0 ± 3,9*
GM-CSF	25,8 ± 3,6*	32,4 ± 4,2*	24,7 ± 0,3	28,6 ± 0,7
Рана + ЭГ Wound + EH	27,7 ± 1,8*	31,9 ± 6,1*	24,2 ± 4,6	13,3 ± 0,4*
ЭГ EH	35,6 ± 4,7*	40,3 ± 3,8*	28,6 ± 1,9	43,1 ± 12,5
Рана + TNFα Wound + TNFα	17,1 ± 1,9	15,4 ± 0,8	5,9 ± 0,7*	29,4 ± 1,7
Рана + ЭГ + GM-CSF Wound + EH + GM-CSF	34,5 ± 7,3	18,5 ± 3,5	–	–

Примечание. * – p < 0,05 по сравнению с контролем. n = 4.

Note. *, p < 0.05 compared to control. n = 4.

 

В Ф2-фагоцитах, напротив, связывание DBA, но не conA, снизилось на 30%. Известно, что рецепторы к сonА экспрессируются при апоптозе или аутофагии [14] в ответ на увеличение продукции активных форм кислорода (АФК), поэтому увеличение связывания этого лектина при ранении указывает на активацию Ф1-фагоцитов. Изменения в связывании сonА в Ф1-фагоцитах при действии препаратов свидетельствуют о том, что ЭГ и GM-CSF, по-видимому, стимулируют функциональную активность Ф1-фагоцитов у интактных животных, но при ранении достоверного эффекта по сравнению с действием самого ранения не оказывают, а TNFα даже ингибирует повышение функциональной активности, вызываемое самим ранением. По-видимому, это связано с тем, что, несмотря на то, что GM-CSF и TNFα известны свой способностью вызывать поляризацию макрофагов по М1-пути, их эффекты могут регулироваться по механизму обратной связи [4].

TNFα и GM-CSF снижали связывание DBA в Ф1-фагоцитах у раненых животных по сравнению с ранением, хотя GM-CSF не влиял на показатель у интактных животных. ЭГ не влиял на связывание DBA в Ф1-фагоцитах ни у интактных, ни у раненых животных. Связывание DBA с поверхностными рецепторами характеризует диффенцирующиеся клетки [12], и полученные результаты свидетельствуют о возможном снижении уровня дифференцированных клеток Ф1 в общем пуле в связи с необходимостью их восполнения вследствие рекрутирования в поврежденные ткани. Это предположение подтверждается тенденцией к снижению в 1,4 раза связывания в Ф1-фагоцитах раненых животных лектина из Glycine max (SBA), с 26,6 ± 2,0% до 18,7 ± 3,1% (p > 0,05). Уровень SBA находится в прямом соотношении со зрелостью клеток [10]. Снижение числа дифференцированных клеток при инъекции GM-CSF и TNFα подтверждает, что эти цитокины ускоряют рекрутирование Ф1-фагоцитов в ткани раненых животных. Отсутствие же эффекта ЭГ на уровень зрелости клеток, по-видимому, связано с тем, что он не влиял на рекрутирование Ф1-фагоцитов.

В Ф2-фагоцитах, как и в Ф1, ЭГ и GM-CSF стимулировали связывание conA у интактных животных по сравнению с контролем. У раненых животных инъекция GM-CSF, как и TNFα, не вызывала такого повышения по сравнению с ранением, а ЭГ достоверно повышал уровень связывания. Это свидетельствует в пользу предположения о том, что GM-CSF стимулирует преимущественно активность Ф1-фагоцитов, а ЭГ – Ф2-клеток. Совместное введение ЭГ и GM-CSF раненым животным не приводило к стимуляции связывания conA по сравнению с контролем. Можно предположить наличие конкуренции между двумя препаратами за связывание с рецептором, содержащим остаток маннозы.

Ни ЭГ, ни GM-CSF не влияли на связывание DBA в Ф2-фагоцитах интактных животных по сравнению с контролем, но оба препарата снижали более чем в 2 раза этот показатель у раненых животных. Это свидетельствует об увеличении под их влиянием числа незрелых Ф2-фагоцитов. По-видимому, оба препарата способствуют ускорению рекрутирования Ф2-фагоцитов в ткани. TNFα у раненых животных не влиял на этот показатель по сравнению с контролем, что соответствует полученным данным об отсутствии изменений в содержании Ф2-фагоцитов в этой экспериментальной группе по сравнению с контролем и свидетельствует об отсутствии влияния TNFα на рекрутирование Ф2-фагоцитов.

Происходящие изменения активности фагоцитов при действии препаратов сопровождались различными эффектами на заживление раны. Так, при исходной длине разреза 5,8 ± 1,2 мм, при введении GM-CSF это значение составило 7,4 ± 1,3 мм, TNFα – 3,9 ± 0,8 мм, ЭГ-3,5 ± 0,4 мм. Только ЭГ достоверно (p < 0,05) снижал длину раны.

Таким образом, наблюдающееся при воздействии GM-CSF и TNFα преимушественное рекрутирование Ф1-фагоцитов в ткани раненых животных происходит наряду со снижением их функциональной активности. Это может свидетельствовать о возможной трансформации Ф1-фагоцитов в Ф2-фагоциты для поддержания баланса между про- и антивоспалительными эффектами ранения. В отличие от цитокинов, ЭГ не только подавлял функциональную активность Ф1-фагоцитов, но и стимулировал активность Ф2-фагоцитов и их рекрутирование в ткани. Основываясь на морфофункциональном сходстве между Ф2-фагоцитами и М2-макрофагами, можно предполагать, что такое действие ЭГ способствует заживлению раны в большей степени, чем при воздействии цитокинов.

Выводы

1. GM-CSF и TNFα избирательно модулируют активность двух типов фагоцитов голотурии, с преимущественным влиянием на Ф1-клетки.
2. Скорость заживления раны при воздействии ЭГ более высокая, чем при действии цитокинов, что, по-видимому, связано с его способностью вызывать преимущественную активацию Ф2-фагоцитов и их рекрутирование в ткани.
3. Ф2-фагоциты играют важную роль в ранозаживлении.

Об авторах

Л. С. Долматова

Тихоокеанский океанологический институт имени В.И. Ильичева Дальневосточного отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: dolmatova@poi.dvo.ru

к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии

Россия, Владивосток

Список литературы

Дополнительные файлы