Assessing effects of an antigen complex from opportunistic bacteria on activation of CD54 receptor expression by human promonocytic U937 cell line

Evgeniy O. Kalinichenko; Калиниченко Евгений О.; Olga V. Kozyreva; Козырева Ольга В.; Nikita G. Sidorov; Сидоров Никита Геннадьевич; Ekaterina V. Sorokina; Сорокина Екатерина В.; Natalia A. Mikhailova; Михайлова Наталья А.

doi:10.46235/1028-7221-17236-AEO

Оценка влияния комплекса антигенов условно-патогенных бактерий на активацию экспрессии рецептора CD54 клетками промоноцитарной линии человека U937

Авторы: Калиниченко Е.О.¹, Козырева О.В.¹, Сидоров Н.Г.¹, Сорокина Е.В.¹, Михайлова Н.А.¹
Учреждения:
1. ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»
Выпуск: Том 28, № 4 (2025)
Страницы: 919-924
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Дата подачи: 16.04.2025
Дата принятия к публикации: 22.06.2025
Дата публикации: 28.09.2025
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/17236
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-17236-AEO
ID: 17236

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Условно-патогенные бактерии играют важную роль в развитии респираторных инфекций, характеризующихся высокой заболеваемостью и смертностью. Перспективным направлением является применение препаратов на основе условно-патогенных бактерий, стимулирующих иммунитет. Важной задачей при их создании становится определение методов оценки и маркеров, отражающих усиление иммунного ответа. Известно, что для таких целей представляет интерес стимуляция миелоидных клеток. В качестве модели для анализа функциональной активности моноцитов и макрофагов широко применяется клеточная линия U937, происходящая из клеток гистиоцитарной лимфомы человека и обладающая характеристиками, близкими к промоноцитам. Рецептор молекулы CD54 (ICAM-1) представляет собой поверхностный гликопротеин, выполняющий функции адгезионного рецептора и играющий важную роль в обеспечении направленной миграции лейкоцитов из кровотока в воспаленные ткани. В условиях воспалительной стимуляции экспрессия ICAM-1 значительно возрастает на поверхности иммунных клеток, что позволяет рассматривать его как маркер активации компонентов врожденного иммунитета, включая клетки линии U937. В исследовании изучена активация экспрессии рецептора CD54 (ICAM-1) клетками человеческой промоноцитарной линии U937 под воздействием двух вариантов комплекса антигенов условно-патогенных бактерий: с добавлением иммуностимулируюшего сополимера и без него. В состав комплекса антигенов входили антигены из 4 видов условно-патогенных бактерий: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae. В качестве дополнительного иммуностимулирующего агента использовали сополимер 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона гидрохлорида. Для оценки экспрессии CD54 (ICAM-1) на клетках U937 использовали метод проточной цитометрии. Клетки стимулировали пептидогликаном S. aureus (положительный контроль) и исследуемыми вариантами комплекса антигенов условно-патогенных бактерий. Активность клеток оценивали с помощью коэффициента активации, отражающего увеличение экспрессии CD54. Значение коэффициента активации положительного контроля считалось убедительным при достижении не менее 50% (активация клеток эталонным антигеном), в то время как активация клеток под действием исследуемых вариантов комплекса антигенов условно-патогенных бактерий признавалась значимой при коэффициенте активации не менее 30%. Показано, что оба варианта и положительный контроль индуцировали дозозависимое увеличение экспрессии CD54. Оптимальная концентрация стимуляции соответствовала 25 мкг/мл. Выявленный эффект подтвердил способность комплекса антигенов условно-патогенных бактерий активировать клетки моноцитарно-макрофагального ряда и усиливать врожденный иммунный ответ. Полученные результаты подчеркивают значимость использования ICAM-1 как маркера активации иммунных клеток. Апробированный метод является перспективным для оценки эффективности препаратов на основе условно-патогенных бактерий.

Ключевые слова

U937, моноциты, активация клеток, врожденный иммунитет, ICAM-1, CD54, антигены условно-патогенных бактерий

Полный текст

Введение

Условно-патогенные бактерии являются значимыми возбудителями респираторных инфекций, характеризующихся широкой распространенностью, высокой заболеваемостью и смертностью во всем мире. Терапевтические стратегии с использованием антибактериальных средств оказались недостаточно эффективными, особенно у иммунокомпрометированных больных [4, 6, 7]. В связи с этим возникла необходимость усилить иммунный ответ с помощью препаратов, стимулирующих систему врожденного иммунитета, в частности лекарственных средств на основе условно-патогенных бактерий [5].

При разработке таких препаратов важно определить методы оценки и маркеры, которые будут указывать на усиление системы врожденного иммунитета.

Известно, что для таких целей представляет интерес стимуляция миелоидных клеток. В качестве модельных клеток для исследования функций моноцитов и макрофагов часто используется клеточная линия U937, полученная из клеток гистиоцитарной лимфомы человека, так как по своей функциональной активности она схожа с промоноцитами [8, 10].

Согласно литературным данным, рецептор молекулы CD54 (ICAM-1), являясь поверхностным гликопротеином и адгезионным рецептором, играет ключевую роль в привлечении лейкоцитов из кровотока в очаги воспаления. Экспрессия ICAM-1 активно индуцируется на иммунных клетках в ответ на воспалительную стимуляцию [3], что позволяет использовать его как маркер активации клеток врожденного иммунитета, в том числе на клетках U937 [2, 9].

Цель – исследовать активацию экспрессии рецептора CD54 (ICAM-1) клетками человеческой промоноцитарной линии U937 под воздействием комплекса антигенов условно-патогенных бактерий.

Материалы и методы

В работе использовали комплекс антигенов условно-патогенных бактерий (КА), а также КА с добавлением сополимера 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона гидрохлорида (КА + сополимер), в качестве дополнительного иммуностимулятора. КА получали из смеси антигенов условно-патогенных бактерий Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae методом, описанным в патенте [1].

Культура клеток U937 была получена в криоконсервированном виде (ООО «ПраймБиоМед», Россия). Пробирку размораживали на водяной бане при 37 °C, затем клетки отмывали от среды, добавляя их в пробирку с 9 мл среды RPMI-1640 (НПП «ПанЭко», Россия) и центрифугировали 5 мин при 300 g. После этого клетки сеяли в 25- мл флаконы с расчетной плотностью 1 млн/ мл в питательную среду RPMI-1640 с добавлением 25 mM HEPES, 10% инактивированной фетальной телячьей сыворотки, L-глутамина (2 mM), пенициллина (50 ЕД/мл) и стрептомицина (50 мкг/ мл). Флаконы с культурой инкубировали в CO₂-инкубаторе MCO 19AIC (Sanyo, Япония) при 37 °С и 5% CO_2,пересеивая клетки в свежую среду раз в 4-7 дней. Для опыта использовали клетки, находившиеся не более чем на 5-м пассаже.

Для эксперимента по активации клеток готовили бедную культуральную среду RPMI-1640, содержащую 0,5% инактивированной фетальной телячьей сыворотки, 25 mM HEPES, L-глутамин (2 mM), пенициллин (50 ЕД/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл). Подготовленную среду использовали для отмывания выращенных клеток U937 от среды культивирования, как описано выше, и ресуспендировали в ней до концентрации 2 млн/ мл. В 48-луночный культуральный планшет добавляли по 250 мкл суспензии клеток в 21 лунку: 3 лунки предназначались для отрицательного контроля (без добавления ростовых факторов), 9 лунок – для положительного контроля (пептидогликан S. aureus в трех разведениях), и еще 9 лунок – для исследуемого КА. Инкубировали 18 ч при 37 °C и 5% CO₂. После этого в лунки отрицательного контроля добавляли по 250 мкл среды, в лунки положительного контроля – по 250 мкл среды с пептидогликаном S. aureus (Merck, США) в конечной концентрации 25, 12,5 и 6,25 мкг/мл, а в оставшиеся лунки – исследуемый КА в тех же концентрациях. Инкубировали 18 ч при 37 °C и 5% CO₂.

После этого отбирали по 30 мкл суспензии клеток из каждой лунки и переносили в цитометрические пробирки. В пробирки добавляли по 3 мкл раствора меченых фикоэритрином антител к CD54, и инкубировали 20 мин в отсутствии света. Затем добавляли по 20 мкл раствора OptiLyse C (Beckman Coulter, США) для фиксации клеток и инкубировали 15 мин при комнатной температуре в отсутствии света. Пробы отмывали, добавляя по 5 мл фосфатно-солевого буфера, и центрифугировали со скоростью 1000 об/мин в течение 3 мин на центрифуге LMC-3000 (Biosan, Латвия) и удаляли супернатант. Процедуру повторяли трижды. После отмывки меченые антителами клетки ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-солевого буфера и анализировали пробы на проточном цитометре Cytomics FC-500 (Beckman Coulter, США).

Окно клеточной популяции определяли путем оценки фронтального и бокового светорассеивания (ориентируясь на размеры клеток, чтобы исключить из анализа клеточный детрит); в окне оценивали 10 000 клеток, измеряя среднюю интенсивность флуоресценции (mean fluorescence intensity, MFI) в канале FL2 по показателю Xmean.

Коэффициент активации клеток в опыте и положительном контроле рассчитывали как отношение разности средних арифметических значений MFI по трем пробам в соответствующем образце (опыт или положительный контроль) и отрицательном контроле к среднему арифметическому значению MFI в отрицательном контроле. Результат выражали в процентах.

Коэффициент активации положительного контроля считался убедительным при достижении значения не менее 50%. Активация клеток под действием исследуемых вариантов КА признавалась значимой при коэффициенте активации не менее 30%.

Статистический анализ полученных данных был проведен с использованием языка программирования Python. Достоверность различий между группами устанавливали с помощью U-критерия Манна–Уитни. Результаты считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

В проведенных опытах на клетках U937, находящихся на 2-4 пассажах, выявлена экспрессия рецептора CD54 при стимуляции пептидогликаном и обоими вариантами КА (табл. 1, 2, 3). Прирост экспрессии варьировал как в положительном контроле, так и в вариантах с КА, при этом зафиксирован устойчивый дозозависимый эффект на экспрессию CD54, что свидетельствовало об активирующем воздействии исследуемых вариантов КА на клетки моноцитарно-макрофагального ряда. Полученные результаты демонстрировали способность КА стимулировать реакции врожденного иммунного ответа.

Таблица 1. Стимуляция экспрессии CD54 на втором пассаже культуры U937

Table 1. Stimulation of CD54 expression in the second passage of U937 cell culture

Тип образца Sample type	Дозы, мкг/мл Dose, µg/mL	Комплекс антигенов Antigen complex		Комплекс антигенов + сополимер Antigen complex + copolymer
Тип образца Sample type	Дозы, мкг/мл Dose, µg/mL	Уровень экспрессии CD54 (MFI) CD54 expression level (MFI) M±σ	Рост экспрессии CD54, % Growth of CD54 expression, %	Уровень экспрессии CD54 (MFI) CD54 expression level (MFI) M±σ	Рост экспрессии CD54, % Growth of CD54 expression, %
Отрицательный контроль Negative control	0	13,17±0,61	0	12,87±2,68	0
Положительный контроль Positive control	6,25	16,10±1,49*	22,25	21,63±1,50*	68,07
	12,5	20,13±0,95*	52,85	31,30±2,39*	143,2
	25	25,47±6,23*	93,39	37,50±1,61*	191,38
Исследуемый препарат Investigated compound	6,25	15,90±0,66*	20,73	18,13±0,96*	40,87
	12,5	18,03±0,93*	36,9	21,60±1,25*	67,83
	25	18,57±2,02*	41	24,03±1,89*	86,71

Примечание. М – средняя арифметическая; σ – стандартное отклонение; * р < 0,05 – достоверность различий по сравнению с отрицательным контролем (U-критерий Манна–Уитни).

Note. M, the arithmetic mean; σ, the standard deviation; * p < 0.05, the reliability of differences compared to the negative control (Mann–Whitney U test).

Таблица 2. Стимуляция экспрессии CD54 на третьем пассаже культуры U937

Table 2. Stimulation of CD54 expression in the third passage of U937 cell culture

Тип образца Sample type	Дозы, мкг/мл Dose, µg/mL	Комплекс антигенов Antigen complex		Комплекс антигенов + сополимер Antigen complex + copolymer
Тип образца Sample type	Дозы, мкг/мл Dose, µg/mL	Уровень экспрессии CD54 (MFI) CD54 expression level (MFI) M±σ	Рост экспрессии CD54, % Growth of CD54 expression, %	Уровень экспрессии CD54 (MFI) CD54 expression level (MFI) M±σ	Рост экспрессии CD54, % Growth of CD54 expression, %
Отрицательный контроль Negative control	0	15,77±0,55	0	11,78±1,80	0
Положительный контроль Positive control	6,25	18,93±0,21*	20,04	18,57±0,45*	57,64
	12,5	22,87±0,75*	45,02	23,80±1,21*	102,04
	25	25,47±1,31*	61,51	30,3±1,4*	157,22
Исследуемый препарат Investigated compound	6,25	18,47±0,86*	17,12	16,27±0,59*	38,12
	12,5	20,30±0,69*	28,73	17±1*	44,31
	25	23,13±0,40*	46,67	20,10±0,53*	70,63

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

Таблица 3. Стимуляция экспрессии CD54 на четвертом пассаже культуры U937

Table 3. Stimulation of CD54 expression in the fourth passage of U937 cell culture

Тип образца Sample type	Дозы, мкг/мл Dose, µg/mL	Комплекс антигенов Antigen complex		Комплекс антигенов + сополимер Antigen complex + copolymer
Тип образца Sample type	Дозы, мкг/мл Dose, µg/mL	Уровень экспрессии CD54 (MFI) CD54 expression level (MFI) M±σ	Рост экспрессии CD54, % Growth of CD54 expression, %	Уровень экспрессии CD54 (MFI) CD54 expression level (MFI) M±σ	Рост экспрессии CD54, % Growth of CD54 expression, %
Отрицательный контроль Negative control	0	15,20±0,99	0	16,83±0,35	0
Положительный контроль Positive control	6,25	18,65±0,92*	22,7	21,97±0,78*	30,54
	12,5	22,30±0,14*	46,71	26,30±1,73*	56,27
	25	31,10±0,85*	104,61	33,4±3,0*	98,45
Исследуемый препарат Investigated compound	6,25	17,80±0,57*	17,11	19,90±1,68*	18,24
	12,5	19,75±0,64*	29,93	19,63±1,72*	16,64
	25	22,65±1,91*	49,01	23,13±1,17*	37,43

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

Оба исследуемых варианта КА в дозазависимой манере влияли на активацию экспрессии рецептора CD54 (ICAM-1) клетками промоноцитарной линии человека U937. Целевая степень активации устойчиво наблюдалась в концентрации 25 мкг/мл. Таким образом, данный метод и маркер являются перспективными инструментами для оценки активации клеток врожденного иммунитета в ответ на применение лекарственных средств на основе условно-патогенных бактерий.

Заключение

Результаты нашего исследования подтверждают значимость использования ICAM-1 как маркера активации клеток моноцитарно-макрофагального ряда при воздействии комплекса антигенов условно-патогенных бактерий. Это открывает перспективу применения апробированного метода для оценки влияния препаратов на основе условно-патогенных бактерий на врожденный иммунитет.

Об авторах