Изменение экспрессии генов IFNα и IFNβ под воздействием мирнк, направленных к гену Nup98 при инфекции, вызванной ВПГ-1 in vitro

Полный текст

Введение

Вирус простого герпеса 1-го типа (ВПГ- 1) таксономически относится к подсемейству α-герпесвирусов и представляет собой сложноорганизованный вирус с двухцепочечной ДНК. Вызываемые ВПГ-1 инфекции являются чрезвычайно распространенными в человеческой популяции, глобальный уровень инфицированного населения в возрасте до 50 лет составляет 65% [1]. Помимо губных и генитальных высыпаний, среди заболеваний, причиной которых может быть ВПГ-1, выделяют стромальный герпетический кератит, энцефалит простого герпеса и болезнь Альцгеймера [3]. Исходя из этого, адаптивный иммунный ответ очень важен для контроля инфекции ВПГ, ее реактивации и осложнений [4]. Одними из ключевых компонентов адаптивного иммунитета являются IFNα и IFNβ, играющие важную роль на ранних стадиях инфекции, вызванных герпесвирусами [5, 6]. Повышение экспрессии IFNα влечет за собой индукцию системного иммунного ответа (посредством активации NK-клеток, Т-лимфоцитов и усиления их миграции в очаг воспаления), а также подавление вирусного жизненного цикла посредством стимуляции цитотоксичности NK-клеток и дифференцировки Th1-клеток [7]. В свою очередь, основной функцией IFNβ является стимуляция экспрессии интерферон-стимулирующих генов (ISGs), чьи продукты экспрессии будут ингибировать цикл вирусной репродукции на разных ее этапах [7].

Для лечения герпетической инфекции в настоящее время используется широкий арсенал средств медикаментозной терапии и иных подходов, однако с течением времени наблюдается рост заболеваемости инфекции ВПГ-1 в популяции [2]. Исходя из этого, в настоящее время необходим поиск новых подходов, направленных на снижение заболеваемости инфекции ВПГ-1 и индуцированных ей осложнений. Перспективным подходом в данной ситуации может стать использование явления РНК-интерференции, лежащей в основе механизма действия потенциальных противогерпетических препаратов нового поколения. РНК-интерференция – целевой процесс ингибирования трансляции мРНК, что влечет за собой нарушение процесса биосинтеза белка [8].

В ходе своей репродукции, ВПГ-1 импортирует вирусную ДНК через ядерно-поровый комплекс (ЯПК), находящийся в мембране клеточного ядра и состоящего из белков-нуклеопоринов (Nup98, Nup205, NXF1 и др.) [9]. Следовательно, нарушение структуры ЯПК в результате миРНК-опосредованного ингибирования образования белков-нуклеопоринов может гипотетически приводить к снижению репродукции ВПГ-1.

Исходя из вышесказанного, целью настоящего исследования является оценка противовирусного эффекта миРНК, направленных к клеточному гену Nup98, а также оценка динамики экспрессии цитокинов IFNα и IFNβ на модели in vitro.

Материалы и методы

Подбор миРНК, олигонуклеотидов, комплексы миРНК, использованные в работе, методика трансфекции клеток миРНК с последующим заражением, использованные в работе, выделение тотальной РНК, проведение ОТ-ПЦР-РВ, определение экспрессии цитокинов, методика титрования вируса по конечной точке ЦПД представлены в нашем более раннем исследовании [10].

В работе был использован использован ВПГ- 1 (коллекция ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Россия). Культивирование и определение титра вируса проводилось на культуре клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки-мармазетки Vero (ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Россия). Для заражения использовали множественность инфицирования (мн. з., MOI), равную 0,01 ед. Клетки Vero выращивали в среде DMEM (НПП «ПанЭко», Россия), содержащей 10% эмбриональной сыворотки коров (ЭСК) Gibco (Thermo Fisher Scientific, Новая Зеландия), 40 мкг/мл гентамицина (НПП «ПанЭко», Россия), и 300 мкг/мл L-глутамина (НПП «ПанЭко», Россия) при 37 °С в CO₂-инкубаторе.

Тотальную РНК выделяли из клеточного лизата набором ExtractRNA (ЗАО «Евроген», Россия). Для постановки реакции обратной транскрипции (ОТ) применяли набор реагентов ОТ-1 (ООО «Синтол», Россия). Для ПЦР-РВ использовали набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA Green и референсного красителя ROX (ООО «Синтол», Россия). Рабочая концентрация праймеров составила 10 пмоль на реакционную смесь. Реакция ПЦР-РВ проводилась в амплификаторе ДТ-96 (ООО «ДНК-технология», Россия). Температурно-временной режим составил 95 °С в течение 5 мин (1 цикл), 62 °С – 40 с, 95 °С – 15 с (40 циклов). Праймеры для определения экспрессии цитокинов (ООО «Синтол», Россия) представлены в исследованиях [11]. Специфичность полученного сигнала оценивалась посредством выстраивания кривой при амплификации. Оценка изменения экспрессии целевого гена проводилась с использованием критерия 2^-ΔΔCT [12]. Оценку экспрессии IFNα и IFNβ проводили относительно групп неспецифического контроля с миРНК siL2. Выполнялся расчет разницы трех повторов значений пороговых циклов ПЦР (ΔCt) между исследуемыми генами неспецифического контроля siL2 и геном домашнего хозяйства GAPDH.

Статистическую значимость полученных результатов определяли с помощью критерия Манна–Уитни. Разница считалась достоверной при p ≤ 0,01 и p ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение

При оценке противовирусного эффекта миРНК, направленных к гену Nup98 наблюдалось снижение репродукции ВПГ-1 по результатам титрования по ЦПД. При использовании миРНК Nup98.1 в течение 3 суток с момента трансфекции отмечалось достоверное снижение вирусной репродукции на 0,8, 1,2 и 1,5 lgТЦД50/мл (lg тканевых цитотоксических доз 50/мл) относительно контрольной группы siL2. При использовании миРНК Nup98.2 достоверное снижение вирусной активности наблюдалось на 2-е и 3-и сутки с момента трансфекции. Вирусный титр в клетках, обработанных миРНК Nup98.2, был достоверно ниже аналогичного показателя в контрольной группе на 1,2 и 2 lgТЦД50/мл. Полученные данные представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Противовирусный эффект миРНК, специфичных к клеточному гену Nup98

Table 1. Antiviral effect of siRNAs specific to the cellular gene Nup98

Сутки Day	Nup98.1	Nup98.2	siL2
1-е сутки 1st day	6,0±0,2*	6,4±0,6	6,8±0,3
2-е сутки 2nd day	5,7±0,5*	5,7±0,2*	6,9±0,5
3-и сутки 3rd day	5,7±0,2*	5,3±0,4*	7,2±0,2

Примечание. По горизонтали указаны миРНК. * – р < 0,05.

Note. siRNAs are indicated horizontally. *, p < 0.05.

 

При оценке экспрессии гена IFNα не наблюдалось достоверных различий между клетками, обработанными миРНК Nup98.1 и 2, и контрольной группой плацебо (группа, включающая в себя применение неспецифического контроля).

Далее при исследовании было установлено, что наиболее эффективное повышение экспрессии IFNβ наблюдается при трансфекции миРНК Nup98.1. В данном случае достоверный рост экспрессии гена IFNβ относительно неспецифического контроля siL2 выше на 41% и 62%. При использовании миРНК Nup98.2 достоверный рост экспрессии отмечался на 3-и сутки и составил 105% относительно неспецифического контроля siL2. Полученные данные представлены на рисунке 1.

 

Рисунок 1. Влияние миРНК, направленных к гену Nup98 на экспрессию IFNβ

Примечание. * – р ≤ 0,05.

Figure 1. Effect of siRNAs targeting the Nup98 gene on IFNβ expression

Note. *, p ≤ 0.05.

 

Блокировка процесса импорта вирусной ДНК в нуклеоплазму приводила к выраженному снижению вирусной репродукции на модели in vitro, что подтверждает значительную зависимость ВПГ-1 от нормально функционирующего ядерно-порового комплекса. Дополнительно отмечалось достоверное повышение относительно неспецифического контроля уровня экспрессии IFNβ, но не IFNα. Такая избирательная активация экспрессии IFNβ связана с накоплением вирусной ДНК в цитоплазме и последующей за этим активацией регуляторного пути cGAS-STING, ключевого механизма, ответственного за распознавание ДНК в цитоплазме клеток. Активация пути cGAS-STING приводит к повышению экспрессии и выработки IFNβ, который стимулирует индукцию активности ISG, чьи продукты экспрессии подавляют вирусную репродукцию, и усиливает степень презентации антигена, что вызывает значительное моделирование адаптивного иммунного ответа [10].

При оценке изменения экспрессии IFNα не было выявлено достоверных различий между исследуемыми и контрольной группами. Настоящее отсутствие между группами может объясняться тем, что, ввиду особенностей клеточной линии Vero, она обладает ограниченной экспрессией TLR7/9, отвечающих за распознавание вирусной ДНК в эндосомах и последующей индукции IFNα.

Таким образом, избирательное повышение IFNβ отражает наличие локального противовирусного ответа, опосредованного cGAS-STING-путем, в то время как системный IFNα в данной модели не является задействованным.

Заключение

Настоящие данные позволяют сделать вывод, что структуры, принимающие участие в процессе ядерного импорта вирусной ДНУ, являются мишенями для подавления репродукции ВПГ-1, а цитоплазматические сенсоры, распознающие ДНК, играют важную роль в развитии иммунного ответа при блокировке вирусного жизненного цикла. Результаты, полученные в ходе исследования, открывают перспективы для разработки новых стратегий терапии ВПГ-1-инфекции. Полученные результаты открывают перспективы для разработки терапевтических стратегий, направленных на модуляцию cGAS-STING-пути в комбинации с ингибиторами ядерного транспорта вирусов.

Об авторах

Евгений Алексеевич Пашков

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский Университет)

Автор, ответственный за переписку.
Email: pashckov.j@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5682-4581

к.м.н., младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии, старший преподаватель кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Института общественного здоровья имени Ф.Ф. Эрисмана

Россия, 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., 5а; Москва

Лиана Александровна Куликова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский Университет)

Email: LianaKulikovaMira@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0005-0203-1382

студент, лаборант-исследователь лаборатории молекулярной иммунологии

Россия, 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., 5а; Москва

Оксана Анатольевна Свитич

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский Университет)

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1757-8389

д.м.н., член-корр. РАН, заведующая лабораторией молекулярной иммунологии, директор, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии

Россия, 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., 5а; Москва

Виталий Васильевич Зверев

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский Университет)

Email: vitalyzverev@outlook.com
ORCID iD: 0000-0002-0017-1892

д.б.н., академик РАН, научный руководитель, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии

Россия, 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., 5а; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы