Сравнительный анализ иммунорезистентности клинических изолятов энтерококков и стафилококков при хроническом бактериальном простатите

Полный текст

Работа выполнена по теме государственного задания ИКВС УрО РАН № FUUG-2022-0007 «Исследование симбиотических систем про- и эукариот в биологии и медицине».

Введение

Хронические инфекционно-воспалительные заболевания, в том числе хронический бактериальный простатит (ХБП), связаны с персистированием возбудителей в тканях пораженных органов на фоне ярко выраженного (при рецидиве) или вяло текущего (в период ремиссии) воспалительного процесса. Длительное вегетирование патогенов в пораженных локусах сопряжено с постоянным воздействием на микроорганизмы гуморальных и клеточных факторов врожденного и адаптивного иммунитеты. Выживание инфекционных агентов в таких условиях возможно лишь при наличии у них факторов и механизмов супрессии/нейтрализации компонентов антимикробной защиты макроорганизма. Совокупность подобных свойств, называемых факторами персистенции или импединами (от лат. impede – мешать, препятствовать, задерживать), так как их функция ограничивается «обороной без повреждения», обеспечивает возбудителям иммунорезистентность (по аналогии с антибиотикоустойчивостью), которая препятствует процессу саногенеза и элиминации патогенов из инфицированных органов [1, 3, 6].

Несмотря на то, что при хроническом течении ряда инфекционно-воспалительных заболеваний у возбудителей охарактеризован широкий спектр факторов персистенции, включая антилизоцимную, антикомплементарную, антилактоферриновую, sIgA-протеазную, антицитокиновую активности и способность формировать биопленки [8, 12, 16], при ХБП иммунорезистентность приоритетных патогенов, к которым, в частности, относятся энтерококки и стафилококки [17], охарактеризована фрагментарно [10, 11]. При этом особый интерес представляет анализ взаимосвязей персистентных характеристик между собой у грамположительных кокков изученных видов, результаты которого позволят точнее представить видоспецифические особенности паттернов иммунорезистентности данных возбудителей ХБП.

Цель исследования – провести сравнительный анализ факторов иммунорезистентности штаммов энтерококков и стафилококков, выделенных при хроническом бактериальном простатите.

Материалы и методы

В работе использованы культуры стафилококков и энтерококков, выделенные из секрета предстательной железы у больных ХБП классическим бактериологическим методом. Для выделения стафилококков использовали желточно-солевой агар; для энтерококков – Enterococcosel-Agar (CONDA, Испания) и желчно-эскулиновый агар с азидом натрия (HiMedia, Индия). Посевы бактерий инкубировали при 37 °С в течение 18-24 часов.

Видовую принадлежность микроорганизмов оценивали с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF серии Microflex (Bruker Daltonics, Германия), идентификацию микроорганизмов с расчетом коэффициента достоверности проводили с использованием программного обеспечения Maldi BioTyper 3.0.

Материалом для экспериментов in vitro послужили 24 клинических штамма грамположительных кокков разных видов: Enterococcus faecalis (n = 6), Staphylococcus aureus (n = 6), коагулазонегативные стафилококки (сoagulase-negative staphylococci – CоNS), в том числе: S. haemolyticus (n = 6) и S. epidermidis (n = 6).

Фотометрическим методом определяли антилизоцимную активность (АЛА) [2] бактерий и их способность к биопленкообразованию (БПО) [18]; иммуноферментным методом (ИФА) определяли sIgA-протеазную активность бактерий [4] и их антицитокиновую активность (АЦА), т. е. способность микроорганизмов инактивировать в среде про- (IL-6, IL-8, IL-17A, TNFα) и противовоспалительные цитокины (IL-4) [5].

Полученные данные обработаны методами вариационной статистики и методом ранговой корреляции по Спирмену с помощью программы Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., США). Результаты представлены в виде средних значений и ошибок средних (M±m), для сравнения групп использовали критерий Стьюдента, значимыми считали различия при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Сравнительный анализ изученных факторов иммунорезистентности у энтерококков и стафилококков, выделенных при ХБП, показал их сходство по таким персистентным характеристикам, как АЛА, БПО и АЦА в отношении IL-8 и TNFα, а также выявил межвидовую вариабельность данных микроорганизмов по уровням экспрессии ряда изученных свойств, в частности по выраженности у них sIgA-протеазной активности и АЦА в отношении IL-4, IL-6 и IL-17А (табл. 1).

 

Таблица 1. Экспрессия факторов иммунорезистентности энтерококков и стафилококков, выделенных от больных с хроническим бактериальным простатитом

Table 1. Expression of immunoresistance factors of enterococci and staphylococci isolated from patients with chronic bacterial prostatitis

Факторы иммунорезистентности Iimmunoresistance factors		Группы бактерий Groups of bacteria
		E. faecalis (n = 6)	S. aureus (n = 6)	CoNS (n = 12)
АЛА, мкг/мл ALA, μg/mL		1,7±0,1	1,9±0,1	1,8±0,3
БПО, у. е. BFF, c. u.		1,3±0,1	1,41±0,10	1,3±0,1
sIgA-протеазная активность, % sIgA-protease activity, %		24,9±0,3*	2,1±0,1	11,9±0,3*
АЦА в отношении цитокинов (пг/мл) ACA in relation to cytokines (pg/mL)	IL-4	16,7±1,5	0	23,2±1,8*
	IL-6	5,5±0,2	7,8±0,8*	5,6±0,3
	IL-17А	19,9±1,8*	34,2±2,1	23,2±1,9*
	TNFα	52,7±4,1	47,0±3,2	52,8±3,3
	IL-8	46,8±3,5	41,0±3,1	44,9±2,6

Примечание. АЛА – антилизоцимная активность (мкг/мл); БПО – биопленкообразование (у. е.); sIgA-протеазная активность – способность секретировать протеолитические ферменты, разрушающие sIgA (%); АЦА – антицитокиновая активность (пг/мл). * – достоверные межвидовые различия экспрессии признаков (р < 0,05).

Note. ALA, antilysozyme activity (μg/mL); BFF, biofilm formation (с. u); sIgA-protease activity, the ability to secrete proteolytic enzymes that destroy sIgA (%); ACA, anticytokine activity (pg/mL). *, significant interspecific differences in trait expression (р < 0.05).

 

Как видно из представленной таблицы 1, между клиническими штаммами бактерий изученных видов отсутствовали существенные различия в уровнях экспрессии таких персистентных характеристик, как АЛА, БПО и АЦА в отношении IL-8 и TNFα, что косвенно указывало, с одной стороны, на весомый вклад данных свойств в формирование иммунорезистентности возбудителей ХБП, с другой стороны, на их важное значение в обеспечении персистенции патогенов в тканях предстательной железы при этой патологии.

В то же время были обнаружены межвидовые отличия бактерий по выраженности у них других факторов иммунорезистентности (табл. 1).

Так, при определении у клинических штаммов экспрессии sIgA-протеазной активности установлено, что максимальный уровень этого признака регистрировался у изолятов E. faecalis (24,9±0,3%), что в 2,1 раза превышало аналогичный показатель у культур CoNS (11,9±0,3%, р < 0,01) и в 11,9 раз – у S. aureus (2,1±0,1%, р < 0,001).

Что касается АЦА в отношении IL-6, то ее максимальный уровень демонстрировали штаммы S. aureus (7,8±0,8 пг/мл), который был выше этих показателей у изолятов CоNS (5,6±0,3 пг/ мл, р < 0,05) и E. faecalis (5,5±0,2 пг/мл, р < 0,05). Кроме того, изоляты S. aureus отличались от бактерий других видов по уровню АЦА в отношении IL-17А, он у них был выше (34,2±2,1 пг/мл), чем у штаммов CоNS (23,2±1,9 пг/мл, р < 0,05) и E. faecalis (19,9±1,8 пг/мл, р < 0,01). Межвидовые различия наблюдались и по АЦА в отношении IL-4: у культур S. aureus данный признак отсутствовал, тогда как самый высокий его уровень наблюдался у изолятов CоNS (23,2±1,8 пг/мл), который достоверно превышал таковой у штаммов E. faecalis (16,7±1,5 пг/мл, р < 0,05).

Эти данные, очевидно, свидетельствуют о существенном вкладе АЦА в отношении различных цитокинов в формирование видоспецифичности паттернов иммунорезистентности возбудителей ХБП разной таксономической принадлежности.

Для выявления возможных взаимосвязей между свойствами исследуемых штаммов микроорганизмов нами был проведен корреляционный анализ и выявлены взаимосвязи между персистентными свойствами изучаемых видов микроорганизмов (рис. 1).

 

Рисунок 1. Корреляционные плеяды между уровнями экспрессии факторов иммунорезистентности у штаммов: А – E. faecalis, Б – S. aureus, В – CoNS

Figure 1. Correlation pleiades between the expression levels of immunoresistance factors in strains: A, E. faecalis; B, S. aureus; C, CoNS

 

Так, у штаммов S. aureus экспрессия АЦА в отношении IL-8 положительно коррелировала с sIgA-протеазной активностью, АЦА IL-6, АЦА TNFα (r = 0,94, r = 0,7 и r = 0,76 соответственно; p < 0,05). Установлена высокая степень корреляционной зависимости между АЦА IL-6 и АЦА TNFα (r = 0,8; p < 0,05), а также АЦА IL-6 и БПО (r = 0,8; p < 0,05).

У изолятов CoNS отмечена высокая корреляционная зависимость экспрессии АЦА IL-8 и sIgA-протеазной активности; АЦА IL-8 и АЦА IL-6 (r = 0,92; p < 0,05), sIgA-протеазной активности и АЦА IL-6 (r = 0,86; p < 0,05).

У штаммов E. faecalis, также как и у S. aureus, отмечен высокий уровень корреляции между экспрессией АЦА IL-8 и АЦА TNFα (r = 0,75; p < 0,05), и также как у изолятов CoNS – sIgA-протеазной активностью и АЦА IL-6 (r = 0,7; p < 0,05). Отмечены корреляции между экспрессией АЦА IL-4 и БПО (r = 0,87, p < 0,05), АЛА и АЦА IL-17А (r = 0,94, p < 0,05).

У культур энтерококков выявлена обратная корреляционная зависимость выраженности АЦА IL-8 и АЦА IL-17А, АЦА IL-8 и БПО (r = -0,7; p < 0,05); а также БПО и АЦА TNFα (r = -0,76; p < 0,05).

Таким образом, проведенный корреляционный анализ выявил высокую силу корреляционной зависимости у изолятов CoNS и S. aureus между экспрессией АЦА IL-8 и АЦА IL-6, и у штаммов CoNS и E. faecalis между sIgA-протеазной активностью и АЦА IL-6. Обратные корреляционная зависимости между свойствами выявлены у E. faecalis.

Проведенные исследования позволили определить факторы, инактивирующие/супрессирующие антимикробные механизмы защиты у стафилококков разных видов и энтерококков, выделенных при хроническом течении бактериального простатита.

Основной стратегией патогенных микроорганизмов при хронической инфекции является адаптация, направленная на длительное выживание, которое возможно только при реализации эффективных механизмов защиты и нападения.

Развитие и исход заболеваний микробной этиологии зависят от персистентных свойств микроорганизмов, направленных на инактивацию факторов естественной резистентности организма человека.

Факторы, способствующие персистенции, рассматриваются в качестве маркера, обусловливающего длительное переживание патогена в организме хозяина. К таким факторам относят, в частности, способность бактерий деградировать лизоцим, что может приводить в конечном итоге к развитию местного иммунодефицита, с последующим формированием хронического воспалительного процесса, и, несомненно, повлечет за собой дегенеративные изменения в различных отделах репродуктивного тракта.

В нашем исследовании установлен высокий уровень экспрессии sIgA-протеазной активности у штаммов энтерококков, что, очевидно, необходимо для их выживания в условиях действия секреторного иммуноглобулина А, а также свидетельствует о способности sIgA-протеаз E. faecalis поддерживать воспалительный процесс и участвовать в его хронизации [13].

Иммунорезистентность бактерий связана также с их способностью формировать биопленки, которые, прикрепившись к эпителию системы протоков, образуют слизь экзополисахарида или защитные оболочки гликокаликса, что приводит к стойкой иммунологической стимуляции и последующему хроническому воспалению [7].

В настоящее время продолжает активно изучаться способность микроорганизмов к инактивации/нейтрализации различных видов цитокинов [14, 15]. Нами установлено, что энтерококки и стафилококки, выделенные из клинического материала при ХБП, обладают высоким потенциалом к инактивации TNFα, IL-8, IL-6, IL-17А, что, вероятно, позволяет им вмешиваться в формирование иммунного ответа на бактериальную агрессию и тем самым существенно влиять на течение и исход инфекционного процесса. Вместе с тем самая высокая антицитокиновая активность в отношении IL-4 отмечена у CоNS. Эти данные согласуются с результатами другого исследования, в частности [9], где было показано, что наиболее высокий уровень АЦА в отношении IL-4 демонстрировали бактерии вида S. xylosis, относящегося к группе коагулазонегативных стафилококков. Авторы предполагают, что дальнейшие исследования антицитокиновой активности у штаммов стафилококков, выделенных из секрета предстательной железы мужчин с симптомами урогенитальной инфекции, позволят выявить информативные параметры, пригодные для оценки степени тяжести заболевания.

Заключение

Иммунологические особенности местного иммунитета играют ключевую роль в торможении персистенции микроорганизмов. В свою очередь, дисфункция иммунной системы способствует изменению цитокинового профиля и формированию аутоиммунных процессов, хронизации инфекционно-воспалительного процесса. Постоянное воздействие патогенных микроорганизмов приводит к срыву защитных реакций, а следовательно – к декомпенсации и нарушению функции предстательной железы.

Об авторах

Ольга Александровна Пашинина

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – обособленное структурное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: olga25mikro@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9944-3095
SPIN-код: 9638-7336
Scopus Author ID: 57196410629
ResearcherId: J-3331-2018

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов

Россия, г. Оренбург

Татьяна Михайловна Пашкова

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – обособленное структурное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Email: pashkova070782@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8075-8249
SPIN-код: 5146-6190
Scopus Author ID: 57189696210
ResearcherId: J-2057-2018

д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов

Россия, г. Оренбург

Ольга Львовна Карташова

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – обособленное структурное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Email: labpersist@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1487-7546
SPIN-код: 9315-1070
Scopus Author ID: 7003322797
ResearcherId: P-2645-2015

д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов

Россия, г. Оренбург

Лидия Петровна Попова

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – обособленное структурное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Email: labpersist@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3766-6020
SPIN-код: 8577-1007
Scopus Author ID: 56946322300
ResearcherId: J-3339-2018

к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов

Россия, г. Оренбург

Михаил Дмитриевич Кузьмин

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – обособленное структурное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Email: mdk-49@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6349-6053
SPIN-код: 1895-4318

д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов формирования микробиоценозов человека

Россия, г. Оренбург

Виктор Александрович Гриценко

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – обособленное структурное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Email: vag59@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2086-5170
SPIN-код: 7107-1300
Scopus Author ID: 7101892654
ResearcherId: O-9429-2015

д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов формирования микробиоценозов человека

Россия, г. Оренбург

Список литературы

Дополнительные файлы