Влияние наночастиц оксида графена на апоптоз Т-лимфоцитов и клеток линии Jurkat

Полный текст

Введение

Биомедицинские и фармацевтические исследования не теряют своей актуальности. Одно из перспективных направлений в данной области – наноматериалы. В последние десятилетия тема наноматериалов активно развивается благодаря их уникальным физико-химическим свойствам, возможностям направленной модификации и многофункциональности. Наноматериалы могут быть использованы для адресной доставки лекарств и генов, фототермической терапии раковых заболеваний, биовизуализации и пр. [10].

Наноматериалы на основе углерода включают в себя углеродные нанотрубки, фуллерены, наноалмазы, графен и его производные. Преимуществами углеродных материалов являются обширные возможности модификации, малые размеры, большая удельная площадь поверхности, высокая тепло- и электропроводность, уникальные оптические и механические свойства. Углубленное изучение этих материалов позволяет рассматривать их в качестве перспективных биомедицинских агентов, однако требует тщательного исследования их влияния на различные клетки организма [8, 12].

В настоящее время активно изучается биосовместимость графена и его производных. Актуальным является исследование взаимодействия графена с клетками иммунной системы, так как именно они будут первыми контактировать с наноматериалом в случае его биомедицинского применения. В литературе можно найти как отдельные исследования по этой теме, так и комплексные обзоры, охватывающие большое число клеточных популяций [3]. Стоит отметить, что наноматериалы обычно покрывают биосовместимыми полимерами, снижающими их цитотоксичность, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ).

В качестве модели для изучения биосовместимости материалов часто используют линии раковых клеток, так как это облегчает проведение экспериментов и позволяет избавиться от процедур изоляции клеток. Однако, ввиду большей устойчивости раковых клеток, остается спорным вопрос о возможности экстраполяции данных, полученных в ходе подобных экспериментов, на неизмененные клетки.

Мы поставили перед собой цель выяснить, оказывают ли наночастицы оксида графена влияние на жизнеспособность и апоптоз Т-лимфоцитов из крови здоровых людей, а также линию раковых лимфоцитов. Полученные данные позволят расширить наше понимание взаимодействия наноматериалов с живыми системами, а также сделать выводы о достоверности данных, полученных лишь при использовании иммортализированных линий клеток.

Материалы и методы

Исследование проводили в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации 2000 г. и протоколом Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г., на используемую экспериментальную схему получено разрешение Этического комитета «Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН» (IRB00010009) от 30.08.2019. От каждого донора было получено информированное согласие.

В работе использовали наночастицы оксида графена размерами 100-200 нм (маленькие, «м»), и 1-5 мкм (большие, «б») (Ossila Ltd, Великобритания). Функционализированные наночастицы были получены в рамках проекта РНФ № 19-15-00244 (рук. Заморина С.А.). Процедуры модификации наночастиц осуществлялись в ИТХ УрО РАН к.х.н. Нечаевым А.И.

Модификация наночастиц оксида графена линейным (П-ОГ) и разветвленным (рП-ОГ) полиэтиленгликолем осуществлялась методом ковалентной пришивки аминогрупп к карбоксильным группам на поверхности оксида графена через образование амидной связи [5]. Покрытие наночастиц разветвленным ПЭГ по сравнению с линейным улучшает их коллоидную стабильность в растворах. Модификацию структуры и состава оксида графена полиэтиленгликолем подтверждали при помощи УФ- и ИК-Фурье спектроскопии. Определение степени покрытия наночастиц полиэтиленгликолем проводили методом термогравиметрического анализа. Характеристика наночастиц и процедуры функционализации ОГ была представлена нами ранее [7].

Для сравнения эффектов, оказываемых оксидом графена на здоровые и раковые клетки, мы использовали лимфоциты, полученные из крови условно здоровых доноров (n = 5), а также клетки иммортализированной Т-клеточной линии Jurkat 5332 (Российская коллекция клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН, Санкт-Петербург) (n = 5).

Лейкоциты выделяли из крови методом спонтанной седиментации в течение 40 минут при 37 °С, после чего культивировали в полной культуральной среде (CCM, RPMI (Sigma) с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина-амфотерицина (BI), 10% объединенной человеческой сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES. Клетки линии Jurkat 5332 культивировали в питательной среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 Ед пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина B и 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки.

Клетки культивировали в 96-луночных планшетах в концентрации 1 млн клеток/мл. Клетки культивировали во влажной атмосфере в CO₂-инкубаторе при 37 °С и 5% CO₂ в течение суток. Так как число доноров для получения мононуклеарных клеток составляло 5, с клетками Jurkat также проводили серию из пяти экспериментов. Наночастицы П-ОГ и рП-ОГ вносили до конечных концентраций 5 и 25 мкг/мл. Контролем служили лунки без добавления наночастиц.

Для определения жизнеспособности клеток после культивирования в присутствии наночастиц оксида графена использовали краситель Zombie aqua (ZA) (Invitrogen, США). Для оценки числа апоптотирующих клеток использовали Annexin V FITC (BioLegend, США). Оценивали ранний (ZA^-AnnV⁺) и поздний апоптоз/некроз (ZA⁺AnnV⁺) клеток. Лейкоциты из крови доноров также окрашивали антителами к CD3-PB (Miltenyi Biotec, США) и оценивали апоптоз в субпопуляции CD3⁺ (T-клетки). Окрашенные образцы анализировали с использованием проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США). Порог между позитивными (окрашенными) и негативными субпопуляциями клеток определяли с использованием неокрашенных проб, а также контролей флуоресценции минус один (FMO). Данные проточной цитометрии анализировали с помощью программы CytExpert (Beckman Coulter, США).

Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Prizm 8.0.1. Для оценки использовали тест Фридмана и post-hoc тест Данна для множественных сравнений. Результаты представляли в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей – Me (Q_0,25-Q_0,75). Уровень значимости принимали за 0,05.

Результаты и обсуждение

При изучении влияния пегилированых наночастиц оксида графена установлено, что в исследуемых концентрациях они не оказывают влияния на жизнеспособность клеток линии Jurkat вне зависимости от типа поверхностной функционализации (рис. 1). Средние значения жизнеспособности клеток в культурах с добавлением графена колебались в пределах 96,97-97,47% (контроль – 97,18%) Однако частицы малых размеров, функционализированные линейным полиэтиленгликолем, в концентрации 25 мкг/ мл достоверно понижали жизнеспособность Т-лимфоцитов здоровых доноров (рис. 1).

 

Рисунок 1. Влияние оксида графена на жизнеспособность T-лимфоцитов из крови здоровых доноров и клеток линии Jurkat

Примечание. По оси X обозначены тип и концентрация наночастиц оксида графена, по оси Y – процент живых клеток (ZA^-). Контроль – культуры без добавления графена. Звездочкой обозначены значения p < 0,05.

Figure 1. Effect of graphene oxide on the viability of T lymphocytes from the blood of healthy donors and Jurkat cells

Note. The x-axis indicates the type and concentration of nanoparticles; the y-axis is the percentage of living cells (ZA^-). Control, culture without GO. Significant differences (p < 0.05) are indicated (*).

 

Эти же наночастицы (П-ОГм, 25 мкг/мл) повышали число клеток в состоянии позднего апоптоза (рис. 2). В то же время в отношении раннего апоптоза зафиксирован стимулирующий эффект другого типа наночастиц – больших, функционализированных разветвленным полиэтиленгликолем (рП-ОГб, 25 мкг/мл) (рис. 2).

В отношении клеток линии Jurkat не установлено достоверных различий в числе клеток в состоянии раннего и позднего апоптоза в присутствии наночастиц оксида графена (рис. 2).

 

Рисунок 2. Влияние оксида графена на ранний и поздний апоптоз Т-лимфоцитов и клеток линии Jurkat

Примечание. По оси X обозначены тип и концентрация наночастиц оксида графена, по оси Y – процент клеток в состоянии раннего и позднего апоптоза соответственно. Контроль – культуры без добавления графена. Звездочкой обозначены значения p < 0,05.

Figure 2. Effect of graphene oxide on early and late apoptosis of T lymphocytes and Jurkat cells

Note. The x-axis indicates the type and concentration of nanoparticles; the y-axis is the percentage of cells in the state of early and late apoptosis, respectively. Control, culture without GO. Significant differences (p < 0.05) are indicated (*).

 

Ранее нами было установлено, что наночастицы пегилированного оксида графена вызывают снижение прироста клеточной массы Т-лимфоцитов линии Jurkat [1]. При этом статистический анализ не выявил достоверного снижения жизнеспособности клеток, что согласуется с данными текущего исследования. Исходя из полученной информации, можно сделать вывод о том, что пегилированный оксид графена в концентрации 5-25 мкг/мл затрудняет лишь пролиферацию клеток данной линии, не вызывая их гибели.

Проведенные ранее исследования свидетельствуют также о снижении клеточной массы мононуклеарных клеток периферической крови человека при суточной инкубации с оксидом графена [2]. Наиболее выраженный подавляющий эффект наблюдался у частиц, покрытых разветвленным ПЭГом, которые также вызывали образование клеточных агрегатов; а в текущей работе такие частицы повышали число клеток в состоянии раннего апоптоза. Одновременно, не было отмечено влияния наночастиц ОГ на жизнеспособность мононуклеарных клеток [2]. В настоящей работе наночастицы вызывали достоверное снижение процента живых CD3⁺ клеток, однако нельзя игнорировать тот факт, что в целом, показатели жизнеспособности остаются довольно высокими. Кроме того, CD3⁺ клетки составляют 45-70% от всех мононуклеаров крови, и изменения количества живых клеток в этой субпопуляции могли быть не детектируемы в предыдущем исследовании.

Известно, что присутствие наночастиц оксида графена может вызывать гибель клеток, однако оказываемые эффекты находятся в зависимости от размеров и концентрации частиц, а также типа поверхностной функционализации [11]. Например, в отношении Т-клеток известно, что ОГ без поверхностной модификации, а также ОГ-COOH, обладают хорошей биосовместимостью в концентрациях до 25 мкг/мл, в то время как покрытые полиэтиленамином частицы токсичны уже в концентрации 1,6 мкг/мл [5]. При этом в большей степени апоптозу подвержены активированные Т-лимфоциты [9]. Так, в исследованиях Ding с соавт. [5] в состоянии позднего апоптоза находилось до 67,4% клеток из культуры Т-лимфоцитов после суточной инкубации с ОГ. В нашем исследовании Т-клетки не подвергались предварительной активации, что объясняет гораздо меньшую выраженность цитотоксических эффектов графена. Кроме того, при покрытии частиц полиэтиленгликолем, как и в нашем случае, также обнаруживается снижение апоптоза клеток [11].

Для оценки биосовместимости материалов, в том числе графена, зачастую используют линии раковых клеток [4, 6]. В большинстве случаев, как и в нашем исследовании, отмечается, что жизнеспособность раковых клеток снижается в меньшей степени, чем у нормальных. Это может быть объяснено тем, что линии раковых клеток более устойчивы к повреждениям или метаболическим нарушениям. Наше исследование подтверждает, что использование клеточных линий не может полностью заменить эксперименты со здоровыми клетками, а к полученным данным следует относиться с осторожностью: иммортализованные клетки не отображают процессы, происходящие при взаимодействии наноматериала со здоровыми клетками.

Выводы

Показано, что наночастицы оксида графена в концентрации 25 мкг/мл способны вызывать апоптоз Т-клеток, а также снижать их жизнеспособность. Оказываемые эффекты определяются типом поверхностной функционализации и размером частиц. В то же время наночастицы ОГ не оказывали цитотоксического влияния на изучаемые параметры клеток линии Jurkat.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что наночастицы ОГ по-разному влияют на Т-лимфоциты и клетки линии Jurkat, из-за чего данные, полученные при использовании клеточной линии, нельзя экстраполировать на здоровые клетки.

Об авторах

Дарья Игоревна Усанина

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» УрО РАН; ФГАОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: usanina_d@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0436-0890

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии

Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13; Пермь, ул. Букирева, 15

Софья Вадимовна Ужвиюк

ФГАОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Email: kochurova.sofja@yandex.ru

инженер лаборатории клеточной иммунологии и нанобиотехнологии, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук

Пермь, ул. Букирева, 15

Светлана Анатольевна Заморина

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» УрО РАН; ФГАОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Email: mantissa7@mail.ru

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клеточной иммунологии и нанобиотехнологии, профессор кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета

Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13; Пермь, ул. Букирева, 15

Список литературы

Дополнительные файлы