Combined effect of methotrexate and bifidobacteria metabolites on TNFα AND IFNγ production by human peripheral blood mononuclears

Elena V. Ivanova; Иванова Елена Валерьевна; Irina N. Chaynikova; Чайникова Ирина Николаевна; Anastasia V. Bekpergenova; Бекпергенова Анастасия Владимировна; Taisiya A. Bondarenko; Бондаренко Таисия Александровна; Olga E. Chelpachenko; Челпаченко Ольга Ефимовна; Irina A. Zdvizhkova; Здвижкова Ирина Александровна; Natalya B. Perunova; Перунова Наталья Борисовна; Oleg V. Bukharin; Бухарин Олег Валерьевич

doi:10.46235/1028-7221-9839-CEO

Эффект совместного влияния метотрексата и метаболитов бифидобактерий на продукцию TNFα И IFNγ мононуклеарами периферической крови человека

Авторы: Иванова Е.В.¹, Чайникова И.Н.¹, Бекпергенова А.В.¹, Бондаренко Т.А.¹, Челпаченко О.Е.¹, Здвижкова И.А.¹, Перунова Н.Б.¹, Бухарин О.В.¹
Учреждения:
1. Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН – обособленное структурное подразделение ФГБУН Оренбургского федерального исследовательского центра УрО РАН
Выпуск: Том 26, № 3 (2023)
Страницы: 281-286
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Дата подачи: 15.05.2023
Дата принятия к публикации: 29.06.2023
Дата публикации: 11.08.2023
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/9839
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-9839-CEO
ID: 9839

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Метотрексат является препаратом первой линии для лечения ряда ревматических и неревматических заболеваний, включая онкопатологию, однако его терапевтическая эффективность ограничивается выраженной токсичностью в отношении многих органов (миело-, гепато-, нефротоксичность, мукозит, энтерит, дисбиоз различных биотопов человека и др.). В последнее время в ряде исследований установлено, что метаболиты бифидо- и лактобактерий способны усиливать терапевтический эффект химиотерапевтических препаратов и ограничивать их токсические свойства. Целью работы явилось исследование возможного потенцирующего эффекта бесклеточных супернатантов бифидобактерий при совместном с метатрексатом воздействии на секрецию провоспалительных цитокинов TNFα и IFNγ мононуклеарными клетками периферической крови человека. Изучение иммунорегуляторного влияния метаболитов бифидобактерий, метотрексата и их совместной комбинации оценивали по способности изменять продукцию цитокинов TNFα и IFNγ на модели мононуклеаров при сокультивировании в условиях in vitro. Анализ сочетанного влияния метаболитов бифидобактерий и цитостатика на продукцию цитокинов выявил их синергидный эффект в отношении двух ключевых провоспалительных цитокинов – TNFα и IFNγ усиление, по сравнению с контролем (пробы с метотрексатом без супернатантов бифидобактерий), ингибирования продукции раннего провоспалительного цитокина TNFα и, напротив, усиление стимуляции секреции IFNγ, регулирующего клеточные эффекторы. Полученные результаты на примере исследуемых цитокинов свидетельствуют о наличии потенцирующего влияния метаболитов бифидобактерий на противовоспалительные и иммунорегуляторные свойства метотрексата. Таким образом, метаболиты бифидобактерий могут рассматриваться в качестве перспективного средства, потенцирующего терапевтические свойства метотрексата посредством подавления секреции TNFα и стимуляции IFNγ иммунокомпетентными клетками. Дальнейшее изучение сочетанного влияния метотрексата и метаболитов кишечной микробиоты на продукцию цитокинов различных функциональных групп эффекторными клетками целесообразно для разработки способов усиления терапевтического эффекта метотрексата и ограничения его токсических свойств метаболитами бифидобактерий.

Ключевые слова

бифидобактерии, бесклеточные супернатанты, метотрексат, цитокины, мононуклеары периферической крови человека

Полный текст

Введение

Метотрексат является препаратом первой линии для лечения ряда ревматических и неревматических заболеваний, включая онкопатологию. Благодаря иммуносупрессивным свойствам, MTX также используется для лечения аутоиммунных заболеваний [3, 15]. Противовоспалительная и иммуномодулирующая активность МТХ определяют его эффективность применения при воспалительных заболеваниях кишечника, рассеянном склерозе, системных заболеваниях [4]. Механизмы действия MTX как противовоспалительного препарата с иммуномодулирующей активностью включают модуляцию аденозиновой сигнализации, изменение цитокиновых сетей, генерацию активных форм кислорода, регуляцию экспрессии некоторых длинных некодирующих РНК [4], подавление медиатора воспаления алармина HMGB1, хемотаксиса и адгезии воспалительных клеток [3].

Широкое применение MTX ограничивается его токсичностью. Одними из клинически значимых проявлений кишечных нарушений вследствие химиотерапии является мукозит, энтерит, в развитии которых нарушения микробиоты играют решающую роль. Изменение микробиоты кишечника человека под влиянием МТХ носит дозозависимый характер [10, 14]. Вместе с тем установлено, что изменения кишечной микробиоты или ее метаболитов могут непосредственно влиять на эффективность и токсичность терапевтических средств [1, 7]. Так, несмотря на выраженные противовоспалительные эффекты MTX, существует высокая доля пациентов, которые не реагируют на MTX или имеют серьезные побочные токсические эффекты. Предполагают, что эти межиндивидуальные различия частично связаны с микробиотой кишечника пациентов [14]. Поэтому некоторые характеристики кишечного микробиома предлагается рассматривать как предиктор клинического ответа на МТХ [12].

В последнее время в ряде исследований установлено, что метаболиты штаммов микробиоты способны усиливать терапевтический эффект химиотерапевтических препаратов, например, установлено усиление терапевтического эффекта химиотерапевтического препарата 5-фторурацила (5-FU) под влиянием супернатанта лактобактерий Lactobacillus plantarum [2].

Учитывая высокую эффективность, широкое применение и вместе с тем многочисленные побочные реакции MTX, одним из подходов оптимизации лечения и снижения токсичности данного препарата может быть использование природных соединений, являющихся вторичными метаболитами нормобиоты человека с широким спектром биологической активности и способных потенцировать терапевтические эффекты метотрексата. Целью работы явилось исследование возможного потенцирующего эффекта бесклеточных супернатантов бифидобактерий при совместном с МТХ воздействии на секрецию провоспалительных цитокинов TNFα и IFNγ мононуклеарными клетками периферической крови человека.

Материалы и методы

Объектами исследования служили штаммы Bifidobacterium bifidum (ICIS-310, ICIS-643, ICIS-202, ICIS-504, ICIS-629) и Bifidobacterium longum (ICIS-505, ICIS-206, ICIS-500, ICIS-627) из коллекции лаборатории инфекционной симбиологии ИКВС УрО РАН. Микробные метаболиты получали из бульонных культур бифидобактерий двукратным центрифугированием при 3200 об/ мин с последующей фильтрацией (мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, Millipore, США).

Мононуклеарные лейкоциты выделяли из гепаринизированной крови здоровых доноров методом градиентного центрифугирования (400 g) в градиенте плотности фиколл-верографин (Pharmacia, Швеция) плотностью 1,077 г/см³. Продукция провоспалительных цитокинов IFNγ и TNFα исследовалась в культуре мононуклеаров, сокультивируемых с метаболитами бифидобактерий с добавлением метотрексата (МТХ, «Сандоз», Словения; лекарственная форма – раствор для инъекций) (опыт 1) в концентрации 5 мкг/ мл и без МТХ (опыт 2). В качестве контроля были использованы пробы, где к периферическим мононуклеарам добавлялся только МТХ (контроль 1) или культуральная среда (контроль 2). После 24-часовой инкубации клеток (2 × 10⁶) при 37 °С в атмосфере 5% СО₂ в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной фетальной сыворотки (Sigma, США) и 80 мкг/мл гентамицина. Исследования проводили в 9 дублях для каждого штамма и каждого вида цитокинов. Уровень спонтанной продукции цитокинов после сокультивирования мононуклеаров с метаболитами бактерий исследовали ИФА («Цитокин», Санкт-Петербург). Регистрация результатов проводилась на фотометре Multiskan (Labsystems, Финляндия), длина волны 492 нм.

Статистическую обработку полученных данных проводили средствами пакета Statistica 10 (StatSoft, США) с оценкой различий между величинами по критерию Манна–Уитни (р < 0,05).

Результаты и обсуждение

Анализ влияния метаболитов бифидобактерий на модели мононуклеаров периферической крови человека показал, что метаболиты и B. bifidum, и B. longum подавляли продукцию ключевого провоспалительного цитокина TNFα в 3-5 раз относительно контроля лимфоцитов (350,0±15,0 пг/мл), (р ≤ 0,05). Добавление к периферическим мононуклеарам цитостатика MTX без метаболитов бактерий сопровождалось снижением продукции TNFα в 3,5 раза в сравнении с контролем (р ≤ 0,05). Сочетанное влияние метаболитов бифидобактерий и МТХ также характеризовалось ингибирующим эффектом (68,2-84,7 пг/мл) в отношении провоспалительного цитокина TNFα (р ≤ 0,05). Метаболиты штаммов B. longum обладали более выраженным потенцирующим действием в отношении влияния на секрецию данного цитокина (р ≤ 0,05). Концентрация TNFα в среде культивирования снижалась до 60,0±1,5 пг/ мл в присутствии МТХ и метаболитов штамма B. longum ICIS-505 и до 70,1±2,1 пг/ мл – МТХ и метаболитов штамма B. longum ICIS-206 (р ≤ 0,05).

Вместе с тем содержание другого провоспалительного цитокина IFNγ увеличивалось при добавлении к мононуклеарным лейкоцитам как метаболитов бифидобактерий (в 2-3,5 раза в сравнении с контролем лимфоцитов – 30,4±2,3 пг/ мл) (р ≤ 0,05), так и цитостатика MTX (в 2,3 раза относительно контроля) (р ≤ 0,05). Причем выраженность стимулирующего эффекта возрастала при сочетанном влиянии МТХ и метаболитов бифидобактерий (в среднем до 85,4±3,6 пг/ мл) (р ≤ 0,05). Метаболиты штамма B. longum ICIS-206 в присутствии МТХ стимулировали секрецию IFNγ только до 55,0±3,8 пг/ мл (р ≤ 0,05), а штаммов B. longum ICIS-500 и B. bifidum ICIS-643 – до 114,0±4,3 пг/мл и 107,6±6,1 пг/мл, соответственно (р ≤ 0,05).

Таким образом, было установлено разнонаправленное влияние метаболитов бифидобактерий и МТХ, а также их сочетаний на продукцию двух ключевых провоспалительных цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови человека – TNFα и IFNγ. Показано потенцирующее влияние метаболитов бифидобактерий на ингибирующий эффект цитостатика МТХ в отношении продукции лимфоцитами флогогенного фактора TNFα. Наиболее выраженным эффектом обладали метаболиты штаммов B. longum ICIS-505 и B. longum ICIS-206. Вместе с тем, метаболиты бифидобактерий потенцировали стимулирующее влияние МТХ в отношении секреции медиатора клеточного иммунного ответа – IFNγ.

Оценивая полученные в настоящей работе результаты об усилении бесклеточными супернатантами B. bifidum и B. longum эффекта воздействия метатрексата на продукцию провоспалительных цитокинов, можно предположить, что выявленный потенцирующий эффект обеспечивается наличием в культуральных супернатантах бифидобактерий определенного спектра биологически активных молекул (метаболитов), таких как короткоцепочечные жирные кислоты (SCFAs), представленные ацетатом, пропионатом и бутиратом [7]. Различные таксоны микроорганизмов ответственны за синтез SCFAs. Для Bifidobacterium spp. специфичными метаболитами являются ацетат, пропионат, лактат и в меньшей степени бутират. После попадания в эпителиальные клетки кишечника SCFAs выполняют регуляторную роль, взаимодействуя со специфическими рецепторами, связанными с G-белком (GPCR) и/или гистондеацетилазами (HDACs) [6].

В настоящее время метаболитам бифидобактерий отводится важная роль в усилении терапевтического эффекта ряда химиотерапевтических препаратов. Благодаря способности бифидобактерий и их метаболитов к биотрансформации противоопухолевых препаратов [13], образуются соединения с усиленной цитотоксичностью в отношении раковых клеток [9]. Протективный эффект бифидо- и лактобактерий и их метаболитов проявляется в антиоксидантных и антипролиферативных эффектах через ингибирование NF-êB, участвующего в пролиферации клеток и играющего критическую роль в воспалительном процессе [5], в регуляции генов с про- и антиапоптотической активностью [8]. Наряду с бифидобактериями, усиливать действие МТХ могут и Bacteroides fragilis. В работе Zhou B. и соавт. (2022) на мышиной модели коллаген-индуцированного артрита показано, что MTX не оказывает терапевтического эффекта при отсутствии в кишечнике Bacteroides fragilis [15]. Введение B. fragilis восстанавливало эффективность MTX и сопровождалось увеличением уровня бутирата.

Заключение

Поиск перспективных природных компонентов, направленных на уменьшение токсичности и побочных эффектов химиотерапевтических препаратов, в частности метотрексата, представляет собой будущее направление в терапии различных воспалительных, аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний. Современные терапевтические стратегии, использующие кишечную микробиоту и ее метаболиты в сочетании с химиотерапией и иммунотерапией, могут предоставить новые возможности для кишечной микробиоты и ее метаболитов стать адъювантами для специфической терапии пролиферативных заболеваний [11]. Результаты настоящего исследования дают основание для дальнейшей разработки направления, позволяющего рассматривать метаболиты бифидобактерий в качестве перспективного средства, потенцирующего терапевтические свойства метотрексата посредством подавления секреции TNFα и стимуляции IFNγ иммунокомпетентными клетками. Дальнейшее изучение сочетанного влияния цитостатиков, в частности метотрексата, и метаболитов кишечной микробиоты целесообразно для разработки способов усиления терапевтического эффекта метотрексата и ограничения его токсических свойств метаболитами бифидобактерий.

Об авторах

Елена Валерьевна Иванова

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН – обособленное структурное подразделение ФГБУН Оренбургского федерального исследовательского центра УрО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: walerewna13@gmail.com

доктор медицинских наук, доцент, заведующая лабораторией инфекционной симбиологии