Combined effect of methotrexate and bifidobacteria metabolites on TNFα AND IFNγ production by human peripheral blood mononuclears

Elena V. Ivanova; Иванова Елена Валерьевна; Irina N. Chaynikova; Чайникова Ирина Николаевна; Anastasia V. Bekpergenova; Бекпергенова Анастасия Владимировна; Taisiya A. Bondarenko; Бондаренко Таисия Александровна; Olga E. Chelpachenko; Челпаченко Ольга Ефимовна; Irina A. Zdvizhkova; Здвижкова Ирина Александровна; Natalya B. Perunova; Перунова Наталья Борисовна; Oleg V. Bukharin; Бухарин Олег Валерьевич

doi:10.46235/1028-7221-9839-CEO

Combined effect of methotrexate and bifidobacteria metabolites on TNFα AND IFNγ production by human peripheral blood mononuclears

Authors: Ivanova E.V.¹, Chaynikova I.N.¹, Bekpergenova A.V.¹, Bondarenko T.A.¹, Chelpachenko O.E.¹, Zdvizhkova I.A.¹, Perunova N.B.¹, Bukharin O.V.¹
Affiliations:
1. Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences
Issue: Vol 26, No 3 (2023)
Pages: 281-286
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 15.05.2023
Accepted: 29.06.2023
Published: 11.08.2023
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/9839
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-9839-CEO
ID: 9839

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Methotrexate (Mtx) is a first-line drug for the treatment of numerous rheumatic and non-rheumatic disorders, including oncological disdiseases. However, therapeutic efficacy of Mtx is limited by severe toxicity to many organs (myelo-, hepato-, nephrotoxicity, mucositis, enteritis, dysbiosis at various human biotopes, etc.). Recently, a number of studies showed that some metabolites of Bifidobacteria and Lactobacilli are able to enhance effect of chemotherapeutic drugs and limit their toxic properties. The aim of the present work was to study the possible potentiating action of Bifidobacteria cell-free supernatants and methotrexate upon secretion of pro-inflammatory TNFα and IFNγ cytokines by human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The immunoregulatory effects upon production of TNFα and IFNg was evaluated in the in vitro model of cultured PBMC supplemented with Bifidobacteria metabolites, methotrexate, or their combination. Analysis of the combined effect of Bifidobacteria metabolites and Mtx on the cytokine production revealed their synergism towards the key pro-inflammatory cytokines (TNFα and IFNγ). We found an increase against the control cultures (with Mtx only), inhibition of the early pro-inflammatory cytokine TNFα production. On the contrary, we revealed an increased secretion of IFNγ which regulates the effector cells. The results obtained with these cytokines suggest the presence of a potentiating effect of Bifidobacteria metabolites upon anti-inflammatory and immunoregulatory properties of methotrexate. Thus, Bifidobacteria metabolites can be considered a promising agent which potentiates the therapeutic action of methotrexate by suppressing TNFα secretion and stimulating IFNγ by immunocompetent cells. Further studies of the combined effects of Mtx and metabolites from the intestinal microbiota upon the cytokine production by effector cells could be recommended, aiming to enhance therapeutic effect of methotrexate and limit its toxic properties using the Bifidobacteria metabolites.

Keywords

Bifidobacteria, cell-free supernatants, methotrexate, cytokines, peripheral blood mononuclear cells, human

Full Text

Введение

Метотрексат является препаратом первой линии для лечения ряда ревматических и неревматических заболеваний, включая онкопатологию. Благодаря иммуносупрессивным свойствам, MTX также используется для лечения аутоиммунных заболеваний [3, 15]. Противовоспалительная и иммуномодулирующая активность МТХ определяют его эффективность применения при воспалительных заболеваниях кишечника, рассеянном склерозе, системных заболеваниях [4]. Механизмы действия MTX как противовоспалительного препарата с иммуномодулирующей активностью включают модуляцию аденозиновой сигнализации, изменение цитокиновых сетей, генерацию активных форм кислорода, регуляцию экспрессии некоторых длинных некодирующих РНК [4], подавление медиатора воспаления алармина HMGB1, хемотаксиса и адгезии воспалительных клеток [3].

Широкое применение MTX ограничивается его токсичностью. Одними из клинически значимых проявлений кишечных нарушений вследствие химиотерапии является мукозит, энтерит, в развитии которых нарушения микробиоты играют решающую роль. Изменение микробиоты кишечника человека под влиянием МТХ носит дозозависимый характер [10, 14]. Вместе с тем установлено, что изменения кишечной микробиоты или ее метаболитов могут непосредственно влиять на эффективность и токсичность терапевтических средств [1, 7]. Так, несмотря на выраженные противовоспалительные эффекты MTX, существует высокая доля пациентов, которые не реагируют на MTX или имеют серьезные побочные токсические эффекты. Предполагают, что эти межиндивидуальные различия частично связаны с микробиотой кишечника пациентов [14]. Поэтому некоторые характеристики кишечного микробиома предлагается рассматривать как предиктор клинического ответа на МТХ [12].

В последнее время в ряде исследований установлено, что метаболиты штаммов микробиоты способны усиливать терапевтический эффект химиотерапевтических препаратов, например, установлено усиление терапевтического эффекта химиотерапевтического препарата 5-фторурацила (5-FU) под влиянием супернатанта лактобактерий Lactobacillus plantarum [2].

Учитывая высокую эффективность, широкое применение и вместе с тем многочисленные побочные реакции MTX, одним из подходов оптимизации лечения и снижения токсичности данного препарата может быть использование природных соединений, являющихся вторичными метаболитами нормобиоты человека с широким спектром биологической активности и способных потенцировать терапевтические эффекты метотрексата. Целью работы явилось исследование возможного потенцирующего эффекта бесклеточных супернатантов бифидобактерий при совместном с МТХ воздействии на секрецию провоспалительных цитокинов TNFα и IFNγ мононуклеарными клетками периферической крови человека.

Материалы и методы

Объектами исследования служили штаммы Bifidobacterium bifidum (ICIS-310, ICIS-643, ICIS-202, ICIS-504, ICIS-629) и Bifidobacterium longum (ICIS-505, ICIS-206, ICIS-500, ICIS-627) из коллекции лаборатории инфекционной симбиологии ИКВС УрО РАН. Микробные метаболиты получали из бульонных культур бифидобактерий двукратным центрифугированием при 3200 об/ мин с последующей фильтрацией (мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, Millipore, США).

Мононуклеарные лейкоциты выделяли из гепаринизированной крови здоровых доноров методом градиентного центрифугирования (400 g) в градиенте плотности фиколл-верографин (Pharmacia, Швеция) плотностью 1,077 г/см³. Продукция провоспалительных цитокинов IFNγ и TNFα исследовалась в культуре мононуклеаров, сокультивируемых с метаболитами бифидобактерий с добавлением метотрексата (МТХ, «Сандоз», Словения; лекарственная форма – раствор для инъекций) (опыт 1) в концентрации 5 мкг/ мл и без МТХ (опыт 2). В качестве контроля были использованы пробы, где к периферическим мононуклеарам добавлялся только МТХ (контроль 1) или культуральная среда (контроль 2). После 24-часовой инкубации клеток (2 × 10⁶) при 37 °С в атмосфере 5% СО₂ в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной фетальной сыворотки (Sigma, США) и 80 мкг/мл гентамицина. Исследования проводили в 9 дублях для каждого штамма и каждого вида цитокинов. Уровень спонтанной продукции цитокинов после сокультивирования мононуклеаров с метаболитами бактерий исследовали ИФА («Цитокин», Санкт-Петербург). Регистрация результатов проводилась на фотометре Multiskan (Labsystems, Финляндия), длина волны 492 нм.

Статистическую обработку полученных данных проводили средствами пакета Statistica 10 (StatSoft, США) с оценкой различий между величинами по критерию Манна–Уитни (р < 0,05).

Результаты и обсуждение

Анализ влияния метаболитов бифидобактерий на модели мононуклеаров периферической крови человека показал, что метаболиты и B. bifidum, и B. longum подавляли продукцию ключевого провоспалительного цитокина TNFα в 3-5 раз относительно контроля лимфоцитов (350,0±15,0 пг/мл), (р ≤ 0,05). Добавление к периферическим мононуклеарам цитостатика MTX без метаболитов бактерий сопровождалось снижением продукции TNFα в 3,5 раза в сравнении с контролем (р ≤ 0,05). Сочетанное влияние метаболитов бифидобактерий и МТХ также характеризовалось ингибирующим эффектом (68,2-84,7 пг/мл) в отношении провоспалительного цитокина TNFα (р ≤ 0,05). Метаболиты штаммов B. longum обладали более выраженным потенцирующим действием в отношении влияния на секрецию данного цитокина (р ≤ 0,05). Концентрация TNFα в среде культивирования снижалась до 60,0±1,5 пг/ мл в присутствии МТХ и метаболитов штамма B. longum ICIS-505 и до 70,1±2,1 пг/ мл – МТХ и метаболитов штамма B. longum ICIS-206 (р ≤ 0,05).

Вместе с тем содержание другого провоспалительного цитокина IFNγ увеличивалось при добавлении к мононуклеарным лейкоцитам как метаболитов бифидобактерий (в 2-3,5 раза в сравнении с контролем лимфоцитов – 30,4±2,3 пг/ мл) (р ≤ 0,05), так и цитостатика MTX (в 2,3 раза относительно контроля) (р ≤ 0,05). Причем выраженность стимулирующего эффекта возрастала при сочетанном влиянии МТХ и метаболитов бифидобактерий (в среднем до 85,4±3,6 пг/ мл) (р ≤ 0,05). Метаболиты штамма B. longum ICIS-206 в присутствии МТХ стимулировали секрецию IFNγ только до 55,0±3,8 пг/ мл (р ≤ 0,05), а штаммов B. longum ICIS-500 и B. bifidum ICIS-643 – до 114,0±4,3 пг/мл и 107,6±6,1 пг/мл, соответственно (р ≤ 0,05).

Таким образом, было установлено разнонаправленное влияние метаболитов бифидобактерий и МТХ, а также их сочетаний на продукцию двух ключевых провоспалительных цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови человека – TNFα и IFNγ. Показано потенцирующее влияние метаболитов бифидобактерий на ингибирующий эффект цитостатика МТХ в отношении продукции лимфоцитами флогогенного фактора TNFα. Наиболее выраженным эффектом обладали метаболиты штаммов B. longum ICIS-505 и B. longum ICIS-206. Вместе с тем, метаболиты бифидобактерий потенцировали стимулирующее влияние МТХ в отношении секреции медиатора клеточного иммунного ответа – IFNγ.

Оценивая полученные в настоящей работе результаты об усилении бесклеточными супернатантами B. bifidum и B. longum эффекта воздействия метатрексата на продукцию провоспалительных цитокинов, можно предположить, что выявленный потенцирующий эффект обеспечивается наличием в культуральных супернатантах бифидобактерий определенного спектра биологически активных молекул (метаболитов), таких как короткоцепочечные жирные кислоты (SCFAs), представленные ацетатом, пропионатом и бутиратом [7]. Различные таксоны микроорганизмов ответственны за синтез SCFAs. Для Bifidobacterium spp. специфичными метаболитами являются ацетат, пропионат, лактат и в меньшей степени бутират. После попадания в эпителиальные клетки кишечника SCFAs выполняют регуляторную роль, взаимодействуя со специфическими рецепторами, связанными с G-белком (GPCR) и/или гистондеацетилазами (HDACs) [6].

В настоящее время метаболитам бифидобактерий отводится важная роль в усилении терапевтического эффекта ряда химиотерапевтических препаратов. Благодаря способности бифидобактерий и их метаболитов к биотрансформации противоопухолевых препаратов [13], образуются соединения с усиленной цитотоксичностью в отношении раковых клеток [9]. Протективный эффект бифидо- и лактобактерий и их метаболитов проявляется в антиоксидантных и антипролиферативных эффектах через ингибирование NF-êB, участвующего в пролиферации клеток и играющего критическую роль в воспалительном процессе [5], в регуляции генов с про- и антиапоптотической активностью [8]. Наряду с бифидобактериями, усиливать действие МТХ могут и Bacteroides fragilis. В работе Zhou B. и соавт. (2022) на мышиной модели коллаген-индуцированного артрита показано, что MTX не оказывает терапевтического эффекта при отсутствии в кишечнике Bacteroides fragilis [15]. Введение B. fragilis восстанавливало эффективность MTX и сопровождалось увеличением уровня бутирата.

Заключение

Поиск перспективных природных компонентов, направленных на уменьшение токсичности и побочных эффектов химиотерапевтических препаратов, в частности метотрексата, представляет собой будущее направление в терапии различных воспалительных, аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний. Современные терапевтические стратегии, использующие кишечную микробиоту и ее метаболиты в сочетании с химиотерапией и иммунотерапией, могут предоставить новые возможности для кишечной микробиоты и ее метаболитов стать адъювантами для специфической терапии пролиферативных заболеваний [11]. Результаты настоящего исследования дают основание для дальнейшей разработки направления, позволяющего рассматривать метаболиты бифидобактерий в качестве перспективного средства, потенцирующего терапевтические свойства метотрексата посредством подавления секреции TNFα и стимуляции IFNγ иммунокомпетентными клетками. Дальнейшее изучение сочетанного влияния цитостатиков, в частности метотрексата, и метаболитов кишечной микробиоты целесообразно для разработки способов усиления терапевтического эффекта метотрексата и ограничения его токсических свойств метаболитами бифидобактерий.

About the authors

Elena V. Ivanova

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: walerewna13@gmail.com

PhD, MD (Medicine), Associate Professor, Head, Laboratory of Infectious Symbiology