Исследование показателей окислительного фосфорилирования и гликолиза в CD4⁺T-лимфоцитах ВИЧ/ВГС коинфицированных иммунологических неответчиков с применением технологии seahorse

Полный текст

Введение

Для выживания, деления, выполнения эффекторных и регуляторных функций CD4⁺Т-лимфоцитам требуются энергия и макромолекулы, образуемые в ходе различных биохимических реакций. Магистральными метаболическими путями, обеспечивающими клетку не только аденозинтрифосфатом (АТФ), но и множеством промежуточных продуктов синтеза нуклеиновых кислот, белков и липидов являются гликолиз и окислительное фосфорилирование [6]. Эти метаболические пути критически важны для CD4⁺Т-лимфоцитов.

Современным подходом к исследованию метаболической активности клеток является технология анализа внеклеточных потоков (англ. Extracellular flux (XF) analysis) с использованием оборудования Seahorse XF (Agilent Technologies, США). Анализатор клеточного метаболизма Seahorse XF фиксирует скорость поглощения кислорода и скорость закисления среды клетками, что позволяет оценить интенсивность митохондриального дыхания и скорость гликолиза соответственно. Добавление ингибиторов окислительного фосфорилирования и гликолиза расширяет возможности метода, позволяя определять не только базовые биоэнергетические параметры, но и измерять метаболическую приспособляемость клеток. Ввиду того, что технология Seahorse XF стала доступной относительно недавно, исследования с ее применением ограничены, в частности отсутствуют данные о метаболической активности CD4⁺Т-лимфоцитов у коинфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и вирусом гепатита С (ВГС) иммунологических неответчиков на антиретровирусную терапию (АРТ).

Коинфекция ВИЧ и ВГС широко распространена в Пермском крае [1]. По сравнению с ВИЧ моноинфицированными субъектами ВИЧ/ВГС коинфицированные больные подвержены более высокому риску развития СПИД-неассоциированных заболеваний и смерти [3]. Более того, у зараженных ВИЧ коинфекция ВГС повышает вероятность развития иммунологического неответа на АРТ. При этом типе ответа на лечение подавление репликации ВИЧ под действием антиретровирусных препаратов не сопровождается значительным приростом численности CD4⁺Т-лимфоцитов [2]. У иммунологических неответчиков (ИН) глубокая хроническая CD4⁺Т-лимфопения увеличивает риск развития СПИД и смерти [5]. Хотя показано, что нарушение регенерации CD4⁺Т-клеток вызвано непродуктивным делением этих лимфоцитов, причины развития иммунологического неответа у значительной части ВИЧ/ВГС коинфицированных пациентов, получающих АРТ, остаются невыясненными.

Ранее мы показали, что у ИН изменены косвенные показатели энергетического обмена в CD4⁺Т-клетках памяти, а именно увеличена масса митохондрий и снижена экспрессия генов, кодирующих компоненты комплексов электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) [9].

Цель настоящей работы – оценка эффективности окислительного фосфорилирования и гликолиза в CD4⁺Т-лимфоцитах ВИЧ/ВГС коинфицированных иммунологических неответчиков с использованием технологии Seahorse.

Материалы и методы

Проведение исследования было одобрено этическим комитетом Пермского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями (рег. № комитета IRB00008964). Каждый участник подписал информированное согласие. Включенные в исследование пациенты соответствовали следующим требованиям: подтвержденные диагнозы ВИЧ- и ВГС-инфекций, приверженность АРТ в течение двух и более лет, вирусная нагрузка ВИЧ менее 50 копий/мл, отсутствие лечения интерферонами или анти-ВГС препаратами прямого действия.

Были сформированы две группы:

Кровь объемом до 30 мл забирали натощак из кубитальной вены в вакуумные пробирки, содержащие литий гепарин (Weihai Hongyu Medical Devices Cj., Ltd, Китай). Мононуклеарные клетки выделяли путем центрифугирования двукратно разведенной фосфатно-солевым буферным раствором Дульбекко (DPBS, Gibco, США) периферической крови в градиенте плотности Диаколла (1,077 г/мл, «Диаэм»). Выделенные клетки собирали, дважды отмывали раствором DPBS, подсчитывали в камере Горяева, после чего подвергали контролируемому замораживанию в жидком азоте в среде, содержащей 90% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, Gibco, Колумбия) и 10% диметилсульфоксида (AppliChem, Германия). Перед проведением исследования клетки размораживали. Жизнеспособные лимфоциты подсчитывали, окрашивая клетки трипановым синим.

Негативную селекцию CD4⁺Т-лимфоцитов проводили с использованием коммерческого набора Dynabeads Untouched Human CD4 T cells (Invitrogen, США) согласно инструкции производителя.

Изолированные CD4⁺Т-клетки ресуспендировали в среде XF RPMI Medium (Agilent Technologies, США), содержащей 10 мМ глюкозы (Sigma-Aldrich, США), 2 мМ глутамина («Диаэм») и 1 мМ пирувата натрия (Sigma-Aldrich, США), и вносили по 2,5 × 10⁵ клеток в лунки планшета (Agilent Technologies, США), предварительно обработанного поли-D-лизином (50 мкг/ мл, Sigma, США). Планшет центрифугировали в течение 4 мин при 200 g для формирования монослоя клеток. Объем среды в лунке доводили до 175 мкл, планшет инкубировали при +37 °С в течение 60 мин. Активность митохондриального дыхания и гликолиза определяли с использованием анализатора Seahorse XFe96 (Agilent Technologies, США) по показателям скорости потребления кислорода (англ. oxygen consumption rate – OCR) и скорости ацидификации среды (англ. extracellular acidification rate – ECAR) соответственно. Измерения производили на базальном уровне и после внесения ингибиторов дыхательной цепи митохондрий: олигомицина в конечной концентрации 2,5 мкМ, карбонилцианид-4-(трифлуорометокси)фенилгидразона (FCCP; 2 мкМ), ротенона и антимицина А (Р/АА; 0,5 мкМ). Вышеперечисленные реагенты были получены в Agilent Technologies, США.

В пробах определяли базальную скорость потребления кислорода (разница между OCR на базальном уровне и OCR после внесения Р/АА) и максимальную скорость потребления кислорода (разница между OCR после внесения FCCP и OCR после добавления Р/АА). Показатель гликолиза – ECAR – определяли на базальном уровне и в ответ на действие Р/АА. Анализ данных производили с использованием программного обеспечения Wave Desktop (Agilent Technologies, США).

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием непараметрических методов. В выборке рассчитывали медиану и интерквартильный размах – Me (Q_0,25-Q_0,75). Достоверность различий между группами устанавливали с помощью U-критерия Манна–Уитни. Проведение статистических расчетов и построение графиков осуществляли с использованием программы GraphPad Prism 8.0.1.

Результаты и обсуждение

Исследование интенсивности окислительного фосфорилирования в изолированных из периферической крови CD4⁺Т-лимфоцитах показало следующее. У ИН по сравнению с ИО снижена базальная скорость потребления кислорода дыхательной цепью митохондрий в CD4⁺Т-клетках (рис. 1А). Более того, в условиях повышенного запроса на АТФ, созданных внесением разобщителя окислительного фосфорилирования FCCP, митохондрии CD4⁺Т-лимфоцитов ИН не могут достичь показателей интенсивности потребления кислорода, характерных для митохондрий ИО (рис. 1Б). Представленные данные подтверждают полученные нами ранее результаты: у ИН низкая экспрессия генов, кодирующих компоненты ЭТЦ, сопровождается снижением функциональной активности митохондрий CD4⁺Т-лимфоцитов. По-видимому, клетки компенсируют нехватку генерируемой митохондриями АТФ посредством активизации внемитохондриального метаболического пути: гликолиза.

 

Рисунок 1. Базальная (А) и максимальная (Б) скорость потребления кислорода CD4+Т-лимфоцитами ВИЧ/ВГС коинфицированных больных с различной эффективностью ответа на антиретровирусную терапию

Примечание. Группы обследованных: ИН – иммунологические неответчики; ИО – иммунологические ответчики. OCR (англ. oxygen consumption rate) – скорость потребления кислорода. Представлены медианы, интерквартильные интервалы и 10-90% размахи. Статистические расчеты выполнены по методу Манна–Уитни: * – p < 0,05.

Figure 1. CD4⁺T lymphocyte basal (A) and maximal (B) oxygen consumption rates in HIV/HCV coinfected patients with different response efficiency to antiretroviral therapy

Note. Groups: INR, immunological non-responders; IR, immunological responders. OCR, oxygen consumption rate. Medians, interquartile ranges, and 10-90% ranges are shown. Statistical calculations were made according to the Mann–Whitney method: *, p < 0.05.

 

Для оценки этого предположения мы проанализировали, насколько интенсивно протекает гликолиз в CD4⁺Т-лимфоцитах субъектов исследуемых групп. Было установлено, что показатели базального гликолиза в CD4⁺Т-клетках ИН значительно превосходят таковые в соответствующих лимфоцитах ИО (рис. 2). Известно, что покоящиеся клетки получают энергию за счет окислительного фосфорилирования, тогда как гликолитический фенотип характерен для активированных и делящихся Т-лимфоцитов [4]. Ранее было показано, что для CD4⁺Т-клеток ИН свойственнен высокий уровень хронической иммунной активации, ассоциированный, в том числе, с увеличенной плотностью экспрессии транспортера глюкозы Glut1 [7]. Также необходимо отметить, что у ИН малочисленные CD4⁺Т-лимфоциты постоянно получают сигналы для запуска гомеостатической пролиферации, которая, хоть и не является продуктивной, может быть сопряжена с переключением биоэнергетических показателей в пользу гликолиза.

 

Рисунок 2. Скорость закисления среды CD4+Т-лимфоцитами ВИЧ/ВГС коинфицированных больных с различной эффективностью ответа на антиретровирусную терапию

Примечание. Группы обследованных: ИН – иммунологические неответчики; ИО – иммунологические ответчики. ECAR (англ. extracellular acidification rate) – скорость закисления среды. Представлены медианы, интерквартильные интервалы и 10-90% размахи. Статистические расчеты выполнены по методу Манна–Уитни: *** – p < 0,001.

Figure 2. Rate of medium acidification by CD4⁺T lymphocytes in HIV/HCV coinfected patients with different response efficiency to antiretroviral therapy

Note. Groups: INR, immunological non-responders; IR, immunological responders. ECAR, extracellular acidification rate. Medians, interquartile ranges, and 10-90% ranges are shown. Statistical calculations were made according to the Mann–Whitney method: ***, p < 0.001.

 

Заключение

Таким образом, мы показали, что при иммунологическом неответе на АРТ у ВИЧ/ВГС коинфицированных больных увеличена гликолитическая активность CD4⁺Т-лимфоцитов, что может свидетельствовать об активированном статусе и готовности клеток к пролиферации. Примечательно, что этот феномен не сопровождается соответствующим приростом интенсивности окислительного фосфорилирования в митохондриях. Более того, интенсивность работы ЭТЦ митохондрий в CD4⁺Т-клетках ИН снижается. Можно предположить, что лимфоциты, испытывающие потребность в АТФ и макромолекулах, оказываются неспособными скоординированно изменять свой метаболизм для удовлетворения потребностей. Следует отметь, что нарушение работы ЭТЦ останавливает клеточный цикл и не позволяет клеткам делиться in vitro [8], а гликолиз, хоть и поставляет АТФ и субстраты для синтеза белков, липидов и нуклеиновых кислот дочерних лимфоцитов, не может компенсировать недостаточность функциональной активности митохондрий. По-видимому, у ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН отмечается дисрегуляция метаболических путей, обеспечивающих биоэнергетические и биосинтетические потребности клетки. Это в свою очередь может вносить вклад в низкую регенеративную способность CD4⁺Т-лимфоцитов.

Благодарности

В работе было использовано оборудование ЦКП «Исследования материалов и вещества» ПФИЦ УрО РАН.

Об авторах

Лариса Борисовна Королевская

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Автор, ответственный за переписку.
Email: bioqueen@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9840-7578

кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии

Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Виолетта Викторовна Власова

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Email: violetbaudelaire73@gmail.com

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии

Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Надежда Геннадьевна Шмагель

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Email: shmagel_ng@iegm.ru

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии

Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Евгения Владимировна Сайдакова

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Email: radimira@list.ru

доктор биологических наук, заведующая лабораторией молекулярной иммунологии

Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Список литературы

Дополнительные файлы