Study of oxidative phosphorylation and glycolysis in CD4⁺T lymphocytes of HIV/HCV coinfected immunological non-responders by means of the seahorse technology

Full Text

Введение

Для выживания, деления, выполнения эффекторных и регуляторных функций CD4⁺Т-лимфоцитам требуются энергия и макромолекулы, образуемые в ходе различных биохимических реакций. Магистральными метаболическими путями, обеспечивающими клетку не только аденозинтрифосфатом (АТФ), но и множеством промежуточных продуктов синтеза нуклеиновых кислот, белков и липидов являются гликолиз и окислительное фосфорилирование [6]. Эти метаболические пути критически важны для CD4⁺Т-лимфоцитов.

Современным подходом к исследованию метаболической активности клеток является технология анализа внеклеточных потоков (англ. Extracellular flux (XF) analysis) с использованием оборудования Seahorse XF (Agilent Technologies, США). Анализатор клеточного метаболизма Seahorse XF фиксирует скорость поглощения кислорода и скорость закисления среды клетками, что позволяет оценить интенсивность митохондриального дыхания и скорость гликолиза соответственно. Добавление ингибиторов окислительного фосфорилирования и гликолиза расширяет возможности метода, позволяя определять не только базовые биоэнергетические параметры, но и измерять метаболическую приспособляемость клеток. Ввиду того, что технология Seahorse XF стала доступной относительно недавно, исследования с ее применением ограничены, в частности отсутствуют данные о метаболической активности CD4⁺Т-лимфоцитов у коинфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и вирусом гепатита С (ВГС) иммунологических неответчиков на антиретровирусную терапию (АРТ).

Коинфекция ВИЧ и ВГС широко распространена в Пермском крае [1]. По сравнению с ВИЧ моноинфицированными субъектами ВИЧ/ВГС коинфицированные больные подвержены более высокому риску развития СПИД-неассоциированных заболеваний и смерти [3]. Более того, у зараженных ВИЧ коинфекция ВГС повышает вероятность развития иммунологического неответа на АРТ. При этом типе ответа на лечение подавление репликации ВИЧ под действием антиретровирусных препаратов не сопровождается значительным приростом численности CD4⁺Т-лимфоцитов [2]. У иммунологических неответчиков (ИН) глубокая хроническая CD4⁺Т-лимфопения увеличивает риск развития СПИД и смерти [5]. Хотя показано, что нарушение регенерации CD4⁺Т-клеток вызвано непродуктивным делением этих лимфоцитов, причины развития иммунологического неответа у значительной части ВИЧ/ВГС коинфицированных пациентов, получающих АРТ, остаются невыясненными.

Ранее мы показали, что у ИН изменены косвенные показатели энергетического обмена в CD4⁺Т-клетках памяти, а именно увеличена масса митохондрий и снижена экспрессия генов, кодирующих компоненты комплексов электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) [9].

Цель настоящей работы – оценка эффективности окислительного фосфорилирования и гликолиза в CD4⁺Т-лимфоцитах ВИЧ/ВГС коинфицированных иммунологических неответчиков с использованием технологии Seahorse.

Материалы и методы

Проведение исследования было одобрено этическим комитетом Пермского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями (рег. № комитета IRB00008964). Каждый участник подписал информированное согласие. Включенные в исследование пациенты соответствовали следующим требованиям: подтвержденные диагнозы ВИЧ- и ВГС-инфекций, приверженность АРТ в течение двух и более лет, вирусная нагрузка ВИЧ менее 50 копий/мл, отсутствие лечения интерферонами или анти-ВГС препаратами прямого действия.

Были сформированы две группы:

Кровь объемом до 30 мл забирали натощак из кубитальной вены в вакуумные пробирки, содержащие литий гепарин (Weihai Hongyu Medical Devices Cj., Ltd, Китай). Мононуклеарные клетки выделяли путем центрифугирования двукратно разведенной фосфатно-солевым буферным раствором Дульбекко (DPBS, Gibco, США) периферической крови в градиенте плотности Диаколла (1,077 г/мл, «Диаэм»). Выделенные клетки собирали, дважды отмывали раствором DPBS, подсчитывали в камере Горяева, после чего подвергали контролируемому замораживанию в жидком азоте в среде, содержащей 90% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, Gibco, Колумбия) и 10% диметилсульфоксида (AppliChem, Германия). Перед проведением исследования клетки размораживали. Жизнеспособные лимфоциты подсчитывали, окрашивая клетки трипановым синим.

Негативную селекцию CD4⁺Т-лимфоцитов проводили с использованием коммерческого набора Dynabeads Untouched Human CD4 T cells (Invitrogen, США) согласно инструкции производителя.

Изолированные CD4⁺Т-клетки ресуспендировали в среде XF RPMI Medium (Agilent Technologies, США), содержащей 10 мМ глюкозы (Sigma-Aldrich, США), 2 мМ глутамина («Диаэм») и 1 мМ пирувата натрия (Sigma-Aldrich, США), и вносили по 2,5 × 10⁵ клеток в лунки планшета (Agilent Technologies, США), предварительно обработанного поли-D-лизином (50 мкг/ мл, Sigma, США). Планшет центрифугировали в течение 4 мин при 200 g для формирования монослоя клеток. Объем среды в лунке доводили до 175 мкл, планшет инкубировали при +37 °С в течение 60 мин. Активность митохондриального дыхания и гликолиза определяли с использованием анализатора Seahorse XFe96 (Agilent Technologies, США) по показателям скорости потребления кислорода (англ. oxygen consumption rate – OCR) и скорости ацидификации среды (англ. extracellular acidification rate – ECAR) соответственно. Измерения производили на базальном уровне и после внесения ингибиторов дыхательной цепи митохондрий: олигомицина в конечной концентрации 2,5 мкМ, карбонилцианид-4-(трифлуорометокси)фенилгидразона (FCCP; 2 мкМ), ротенона и антимицина А (Р/АА; 0,5 мкМ). Вышеперечисленные реагенты были получены в Agilent Technologies, США.

В пробах определяли базальную скорость потребления кислорода (разница между OCR на базальном уровне и OCR после внесения Р/АА) и максимальную скорость потребления кислорода (разница между OCR после внесения FCCP и OCR после добавления Р/АА). Показатель гликолиза – ECAR – определяли на базальном уровне и в ответ на действие Р/АА. Анализ данных производили с использованием программного обеспечения Wave Desktop (Agilent Technologies, США).

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием непараметрических методов. В выборке рассчитывали медиану и интерквартильный размах – Me (Q_0,25-Q_0,75). Достоверность различий между группами устанавливали с помощью U-критерия Манна–Уитни. Проведение статистических расчетов и построение графиков осуществляли с использованием программы GraphPad Prism 8.0.1.

Результаты и обсуждение

Исследование интенсивности окислительного фосфорилирования в изолированных из периферической крови CD4⁺Т-лимфоцитах показало следующее. У ИН по сравнению с ИО снижена базальная скорость потребления кислорода дыхательной цепью митохондрий в CD4⁺Т-клетках (рис. 1А). Более того, в условиях повышенного запроса на АТФ, созданных внесением разобщителя окислительного фосфорилирования FCCP, митохондрии CD4⁺Т-лимфоцитов ИН не могут достичь показателей интенсивности потребления кислорода, характерных для митохондрий ИО (рис. 1Б). Представленные данные подтверждают полученные нами ранее результаты: у ИН низкая экспрессия генов, кодирующих компоненты ЭТЦ, сопровождается снижением функциональной активности митохондрий CD4⁺Т-лимфоцитов. По-видимому, клетки компенсируют нехватку генерируемой митохондриями АТФ посредством активизации внемитохондриального метаболического пути: гликолиза.

 

Рисунок 1. Базальная (А) и максимальная (Б) скорость потребления кислорода CD4+Т-лимфоцитами ВИЧ/ВГС коинфицированных больных с различной эффективностью ответа на антиретровирусную терапию

Примечание. Группы обследованных: ИН – иммунологические неответчики; ИО – иммунологические ответчики. OCR (англ. oxygen consumption rate) – скорость потребления кислорода. Представлены медианы, интерквартильные интервалы и 10-90% размахи. Статистические расчеты выполнены по методу Манна–Уитни: * – p < 0,05.

Figure 1. CD4⁺T lymphocyte basal (A) and maximal (B) oxygen consumption rates in HIV/HCV coinfected patients with different response efficiency to antiretroviral therapy

Note. Groups: INR, immunological non-responders; IR, immunological responders. OCR, oxygen consumption rate. Medians, interquartile ranges, and 10-90% ranges are shown. Statistical calculations were made according to the Mann–Whitney method: *, p < 0.05.

 

Для оценки этого предположения мы проанализировали, насколько интенсивно протекает гликолиз в CD4⁺Т-лимфоцитах субъектов исследуемых групп. Было установлено, что показатели базального гликолиза в CD4⁺Т-клетках ИН значительно превосходят таковые в соответствующих лимфоцитах ИО (рис. 2). Известно, что покоящиеся клетки получают энергию за счет окислительного фосфорилирования, тогда как гликолитический фенотип характерен для активированных и делящихся Т-лимфоцитов [4]. Ранее было показано, что для CD4⁺Т-клеток ИН свойственнен высокий уровень хронической иммунной активации, ассоциированный, в том числе, с увеличенной плотностью экспрессии транспортера глюкозы Glut1 [7]. Также необходимо отметить, что у ИН малочисленные CD4⁺Т-лимфоциты постоянно получают сигналы для запуска гомеостатической пролиферации, которая, хоть и не является продуктивной, может быть сопряжена с переключением биоэнергетических показателей в пользу гликолиза.

 

Рисунок 2. Скорость закисления среды CD4+Т-лимфоцитами ВИЧ/ВГС коинфицированных больных с различной эффективностью ответа на антиретровирусную терапию

Примечание. Группы обследованных: ИН – иммунологические неответчики; ИО – иммунологические ответчики. ECAR (англ. extracellular acidification rate) – скорость закисления среды. Представлены медианы, интерквартильные интервалы и 10-90% размахи. Статистические расчеты выполнены по методу Манна–Уитни: *** – p < 0,001.

Figure 2. Rate of medium acidification by CD4⁺T lymphocytes in HIV/HCV coinfected patients with different response efficiency to antiretroviral therapy

Note. Groups: INR, immunological non-responders; IR, immunological responders. ECAR, extracellular acidification rate. Medians, interquartile ranges, and 10-90% ranges are shown. Statistical calculations were made according to the Mann–Whitney method: ***, p < 0.001.

 

Заключение

Таким образом, мы показали, что при иммунологическом неответе на АРТ у ВИЧ/ВГС коинфицированных больных увеличена гликолитическая активность CD4⁺Т-лимфоцитов, что может свидетельствовать об активированном статусе и готовности клеток к пролиферации. Примечательно, что этот феномен не сопровождается соответствующим приростом интенсивности окислительного фосфорилирования в митохондриях. Более того, интенсивность работы ЭТЦ митохондрий в CD4⁺Т-клетках ИН снижается. Можно предположить, что лимфоциты, испытывающие потребность в АТФ и макромолекулах, оказываются неспособными скоординированно изменять свой метаболизм для удовлетворения потребностей. Следует отметь, что нарушение работы ЭТЦ останавливает клеточный цикл и не позволяет клеткам делиться in vitro [8], а гликолиз, хоть и поставляет АТФ и субстраты для синтеза белков, липидов и нуклеиновых кислот дочерних лимфоцитов, не может компенсировать недостаточность функциональной активности митохондрий. По-видимому, у ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН отмечается дисрегуляция метаболических путей, обеспечивающих биоэнергетические и биосинтетические потребности клетки. Это в свою очередь может вносить вклад в низкую регенеративную способность CD4⁺Т-лимфоцитов.

Благодарности

В работе было использовано оборудование ЦКП «Исследования материалов и вещества» ПФИЦ УрО РАН.

About the authors

Larisa B. Korolevskaya

Institute of Ecology and Genetic of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: bioqueen@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9840-7578

PhD, Research Scientist, Laboratory of Ecological Immunology

Russian Federation, 13 Golev St., Perm 614081, Пермь

Violetta V. Vlasova

Institute of Ecology and Genetic of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: violetbaudelaire73@gmail.com

Junior Research Scientist at the Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, 13 Golev St., Perm 614081, Пермь

Nadezhda G. Shmagel

Institute of Ecology and Genetic of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: shmagel_ng@iegm.ru

Dr. Sc. (Med.), Senior Research Scientist at the Laboratory of Ecological Immunology

Russian Federation, 13 Golev St., Perm 614081, Пермь

Evgeniya V. Saidakova

Institute of Ecology and Genetic of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: radimira@list.ru

Dr.Sc. (Biol.), Head of the Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, 13 Golev St., Perm 614081, Пермь

References

Supplementary files