Влияние кукурбитурилов на количество и клеточный состав лейкоцитов периферической крови лабораторных животных при парентеральном введении in vivo

Полный текст

Введение

Кукурбитурилы – это наноразмерные кавитанды, имеющие форму тыквы, способные к включению в свою полость различных гидрофобных молекул или их фрагментов, а также связыванию положительно заряженных групп в области порталов [3]. Благодаря подобным свойствам кукурбитурилы способны инкапсулировать различные лекарственные препараты и служить основой для систем доставки. В связи с этим актуальной является оценка биологической безопасности кукурбитурилов. В настоящее время известно, что кукурбитурилы в ряде исследований in vitro и in vivo продемонстрировали низкую токсичность [4, 5, 6, 7, 8, 10, 12]. При применении кукурбитурилов в очень высоких дозах возможны проявления миотоксичности и нейротоксичности, однако в стандартных концентрациях, используемых при комплексообразовании с лекарственными препаратами, признаков токсичности нет. Однако кроме иммунотоксичности необходимо также исследовать и возможные иммуномодулирующие свойства систем доставки, так как иммуностимулирующие либо иммуносупрессирующие эффекты системы могут как усиливать, так и ослаблять действие доставляемого лекарственного средства.

Поскольку кукурбит[n]урилы – это ряд гомологов, отличающихся числом гликольурильных фрагментов, формирующих данную молекулу, а значит, и размером полости, нами для исследований были выбраны кукурбит[6]урил, кукурбит[7]урил и кукурбит[8]урил (СВ[6], СВ[7] и СB[8] соответственно), как обладающие наиболее подходящими для комплексообразования размерами и чаще других применяемые для создания систем лекарственной доставки.

В предыдущих исследованиях мы оценили возможное иммуномодулирующее действие кукурбитурилов [1, 2, 9], было показано, что при культивировании в присутствии CB[n] усиливалась пролиферативную активность клеток и повышалась экспрессию HLA-DR на лимфоцитах, что говорит о иммуностимулирующем действии. Важно отметить, что кукурбитурилы в условиях in vitro практически не оказывали иммуносупрессивного действия, за исключением незначительного снижения экспрессии HLA-DR и продукции активных форм кислорода Т-хелперами в стимулированных культурах [2, 9]. Следовательно, представляется актуальным изучение иммунобезопасности и возможного иммуномодулирующего действия кукурбитурилов в условиях in vivo.

Материалы и методы

В работе были использованы мыши линии BALB/c в возрасте 2-4 мес. Для проведения данного исследования кукурбитурилы разводились в фосфатно-солевом буфере и вводились лабораторным животным внутрибрюшинно.

Животные были разделены на группы по 6-7 мышей, которым внутрибрюшинно трехкратно в течение недели проводили инъекции: первой группе – 0,25 мл фосфатно-солевого буфера, второй группе 4М раствора CB[6], третьей – второй группе 4М раствора CB[7], четвертой – второй группе 4М раствора CB[8]. После каждого введения на следующий день лабораторным животным проводился анализ образцов крови в микропробирки с гепарином. Забор крови проводился через сутки после очередной инъекции. Кровь в количестве 10 мкл получали после надреза кончика хвоста, после проведения манипуляций рану прижигали раствором йода. Мазки крови фиксировали, окрашивали азур-эозином, после чего проводили подсчет количества лейкоцитов.

На следующие сутки после третьего введения животные умерщвлялись декапитацией, после чего проводился набор проб периферической крови объемом 1 мл. Выделение мононуклеарных клеток крови проводили с помощью центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина. Мононуклеарные клетки окрашивали с помощью моноклональных антител с флуоресцентной меткой (CD45-FITC, СD3-APC, CD16-PE/Cy7 и CD19-PE, BioLegend, США), после чего проводили цитометрический анализ с помощью FACS CANTO II.

Результаты и обсуждение

При оценке влияния кукурбит[7]урила на показатели крови после трехкратного введения в течение недели внутрибрюшинно лабораторным животным статистически значимых изменений обнаружено не было. Однако при первом введении у лабораторных животных отмечалось небольшое увеличение относительного количества лимфоцитов после первого введения CB[6] и увеличение доли нейтрофилов после первого введения CB[8] (рис. 1). В то же время после второго и третьего введения кукурбитурилов доли лимфоцитов и нейтрофилов находились в пределах нормы и не имели статистически значимых различий по сравнению с контролем.

 

Рисунок 1. Влияние кукурбитурилов на относительное количество нейтрофилов в периферической крови лабораторных животных

Figure 1. The effect of cucurbiturils on relative number of neitrophiles in the peripheral blood of laboratory animals

 

Далее нами проводилась оценка влияния на субпопуляционный состав лимфоцитов. Было показано, что CB[7] и CB[8] не влияли на соотношение Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и NK-клеток в крови лабораторных животных (табл. 1). При этом CB[6] приводил к увеличению относительного количества В-лимфоцитов и пропорционально снижал долю Т-клеток. Поскольку при проведении оценки общего числа лимфоцитов CB[6] не снижал данный показатель у лабораторных мышей, а, напротив, приводил к повышению содержания лимфоцитов в периферической крови после первого введения, подобные изменения в субпопуляционном составе могут быть связаны прежде всего с увеличением доли В-клеток, а не снижением абсолютного количества Т-лимфоцитов.

 

ТАБЛИЦА 1. Влияние кукурбитурилов на субпопуляционный состав лимфоцитов в периферической крови лабораторных животных

TABLE 1. Effect of cucurbiturils on the subpopulation composition of lymphocytes in the peripheral blood of laboratory animals

	PBS	CB[6]	CB[7]	CB[8]
CD3+	54,50±4,67%	42,90±5,25%*	54,50±3,33	58,20±3,87%
CD19+	32,80±3,58%	50,10±5,86%*	37,60±3,34%	30,10±3,04%
CD16+	4,70±0,91%	5,00±0,67%	4,18±0,76%	4,80±1,77%

Примечание. * – достоверные различия по сравнению с PBS.

Note. *, significant differences compared to PBS.

 

Известно, что мыши линии BALB/c более склонны к развитию гуморального иммунного ответа [11], поэтому подобное увеличение доли B-лимфоцитов также может быть связано с особенностью реагирования данной линии животных. Однако поскольку CB[7] и CB[8] подобного эффекта в виде увеличения доли В-лимфоцитов не оказывали, можно предположить, что CB[6] способен активировать гуморальный иммунитет в условиях in vivo. Ранее в условиях in vitro было продемонстрировано, что СB[6] способен влиять на гуморальный иммунный ответ, усиливая антигенпрезентирующие свойства В-лимфоцитов [9]. Следовательно, кукурбитурилы при парентеральном введении не приводят к снижению количества иммунных клеток у лабораторных животных, но способны влиять на иммунологический баланс.

Подобные результаты могут свидетельствовать о безопасности использования кукурбитурилов в качестве систем доставки in vivo и возможности применения данных наноразмерных кавитандов для модуляции иммунного ответа при лекарственной доставке.

Выводы

Было обнаружено, что введение CB[n] не влияло на показатели крови лабораторных животных, что может свидетельствовать о безопасности данных соединений в условиях in vivo. При этом CB[6] способен оказывать стимулирующее воздействие на гуморальный иммунитет, повышая относительное количество B-лимфоцитов.

Об авторах

Екатерина Александровна Пашкина

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии»

Автор, ответственный за переписку.
Email: pashkina.e.a@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4912-5512

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории клинической иммунопатологии

Россия, Новосибирск

Алина Александровна Актанова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии»

Email: aktanova_al@mail.ru

младший научный сотрудник, лаборатории клинической иммунопатологии

Россия, Новосибирск

Екатерина Александровна Коваленко

ФГБУН «Институт неорганической химии имени А.В. Николаева» Сибирского отделения РАН

Email: e.a.kovalenko@niic.nsc.ru

кандидат химических наук, научный сотрудник

Россия, Новосибирск

Владимир Александрович Козлов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии»

Email: vakoz40@yandex.ru

доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, научный руководитель

Россия, Новосибирск

Список литературы

Дополнительные файлы