Email this article Effect of cucurbiturils on the numbers and differential counts of peripheral blood leukocytes in laboratory animals after in vivo parenteral administration
- Authors: Pashkina E.A.1, Aktanova A.A.1, Kovalenko E.A.2, Kozlov V.A.1
-
Affiliations:
- Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology
- A. Nikolaev Institute of Inorganic Chemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences
- Issue: Vol 26, No 3 (2023)
- Pages: 377-380
- Section: SHORT COMMUNICATIONS
- Submitted: 15.05.2023
- Accepted: 29.06.2023
- Published: 11.08.2023
- URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/9970
- DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-9970-EOC
- ID: 9970
Cite item
Full Text
Abstract
Immunological safety of nanoparticles is an urgent problem for development of drug delivery systems used as the basis for creating these systems. Cucurbit[n]urils (CB[n]) are molecular nanocontainers that can encapsulate various drugs and serve as the basis for delivery systems. Cucurbiturils are low-toxic compounds: under in vitro conditions, they exhibit weak immunomodulatory properties, without sufficient immunotoxicity. The aim of the present study was to evaluate the in vivo effects of cucurbiturils on the number and differential leukocyte counts in peripheral blood.
BALB/c mice aged 2-4 months were used in the work. For this study, cucurbiturils were diluted in phosphate-buffered saline and administered to laboratory animals intraperitoneally (three times a week).
When evaluating the effect of cucurbit[7]uril on blood parameters of the animals after three intraperitoneal injections weekly, no statistically significant changes were registered. However, at first administration, the animals showed a slight increase in relative number of lymphocytes after the first injection of CB[6], and an increased proportion of neutrophils after the first administration of CB[8]. Meanwhile, the proportions of lymphocytes and neutrophils were within normal ranges after the 2nd and 3rd injections of cucurbiturils, and did not show any significant differences against the controls. Moreover, the impact upon the subpopulation composition of peripheral blood lymphocytes in laboratory animals was assessed. After injection of CB[6], there was a decrease in T lymphocytes in the peripheral blood, along with increased proportion of CD19+B lymphocytes compared with the controls. CB[7] and CB[8] injections did not affect the subpopulation profile of peripheral blood lymphocytes.
We have found that intraperitoneal administration of CB[n] did not affect the blood parameters of laboratory animals, thus, probably suggesting the in vivo safety of these compounds. At the same time, CB[6] is able to exert a stimulating effect on humoral immunity by increasing relative contents of B lymphocytes.
Keywords
Full Text
Введение
Кукурбитурилы – это наноразмерные кавитанды, имеющие форму тыквы, способные к включению в свою полость различных гидрофобных молекул или их фрагментов, а также связыванию положительно заряженных групп в области порталов [3]. Благодаря подобным свойствам кукурбитурилы способны инкапсулировать различные лекарственные препараты и служить основой для систем доставки. В связи с этим актуальной является оценка биологической безопасности кукурбитурилов. В настоящее время известно, что кукурбитурилы в ряде исследований in vitro и in vivo продемонстрировали низкую токсичность [4, 5, 6, 7, 8, 10, 12]. При применении кукурбитурилов в очень высоких дозах возможны проявления миотоксичности и нейротоксичности, однако в стандартных концентрациях, используемых при комплексообразовании с лекарственными препаратами, признаков токсичности нет. Однако кроме иммунотоксичности необходимо также исследовать и возможные иммуномодулирующие свойства систем доставки, так как иммуностимулирующие либо иммуносупрессирующие эффекты системы могут как усиливать, так и ослаблять действие доставляемого лекарственного средства.
Поскольку кукурбит[n]урилы – это ряд гомологов, отличающихся числом гликольурильных фрагментов, формирующих данную молекулу, а значит, и размером полости, нами для исследований были выбраны кукурбит[6]урил, кукурбит[7]урил и кукурбит[8]урил (СВ[6], СВ[7] и СB[8] соответственно), как обладающие наиболее подходящими для комплексообразования размерами и чаще других применяемые для создания систем лекарственной доставки.
В предыдущих исследованиях мы оценили возможное иммуномодулирующее действие кукурбитурилов [1, 2, 9], было показано, что при культивировании в присутствии CB[n] усиливалась пролиферативную активность клеток и повышалась экспрессию HLA-DR на лимфоцитах, что говорит о иммуностимулирующем действии. Важно отметить, что кукурбитурилы в условиях in vitro практически не оказывали иммуносупрессивного действия, за исключением незначительного снижения экспрессии HLA-DR и продукции активных форм кислорода Т-хелперами в стимулированных культурах [2, 9]. Следовательно, представляется актуальным изучение иммунобезопасности и возможного иммуномодулирующего действия кукурбитурилов в условиях in vivo.
Материалы и методы
В работе были использованы мыши линии BALB/c в возрасте 2-4 мес. Для проведения данного исследования кукурбитурилы разводились в фосфатно-солевом буфере и вводились лабораторным животным внутрибрюшинно.
Животные были разделены на группы по 6-7 мышей, которым внутрибрюшинно трехкратно в течение недели проводили инъекции: первой группе – 0,25 мл фосфатно-солевого буфера, второй группе 4М раствора CB[6], третьей – второй группе 4М раствора CB[7], четвертой – второй группе 4М раствора CB[8]. После каждого введения на следующий день лабораторным животным проводился анализ образцов крови в микропробирки с гепарином. Забор крови проводился через сутки после очередной инъекции. Кровь в количестве 10 мкл получали после надреза кончика хвоста, после проведения манипуляций рану прижигали раствором йода. Мазки крови фиксировали, окрашивали азур-эозином, после чего проводили подсчет количества лейкоцитов.
На следующие сутки после третьего введения животные умерщвлялись декапитацией, после чего проводился набор проб периферической крови объемом 1 мл. Выделение мононуклеарных клеток крови проводили с помощью центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина. Мононуклеарные клетки окрашивали с помощью моноклональных антител с флуоресцентной меткой (CD45-FITC, СD3-APC, CD16-PE/Cy7 и CD19-PE, BioLegend, США), после чего проводили цитометрический анализ с помощью FACS CANTO II.
Результаты и обсуждение
При оценке влияния кукурбит[7]урила на показатели крови после трехкратного введения в течение недели внутрибрюшинно лабораторным животным статистически значимых изменений обнаружено не было. Однако при первом введении у лабораторных животных отмечалось небольшое увеличение относительного количества лимфоцитов после первого введения CB[6] и увеличение доли нейтрофилов после первого введения CB[8] (рис. 1). В то же время после второго и третьего введения кукурбитурилов доли лимфоцитов и нейтрофилов находились в пределах нормы и не имели статистически значимых различий по сравнению с контролем.
Рисунок 1. Влияние кукурбитурилов на относительное количество нейтрофилов в периферической крови лабораторных животных
Figure 1. The effect of cucurbiturils on relative number of neitrophiles in the peripheral blood of laboratory animals
Далее нами проводилась оценка влияния на субпопуляционный состав лимфоцитов. Было показано, что CB[7] и CB[8] не влияли на соотношение Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и NK-клеток в крови лабораторных животных (табл. 1). При этом CB[6] приводил к увеличению относительного количества В-лимфоцитов и пропорционально снижал долю Т-клеток. Поскольку при проведении оценки общего числа лимфоцитов CB[6] не снижал данный показатель у лабораторных мышей, а, напротив, приводил к повышению содержания лимфоцитов в периферической крови после первого введения, подобные изменения в субпопуляционном составе могут быть связаны прежде всего с увеличением доли В-клеток, а не снижением абсолютного количества Т-лимфоцитов.
ТАБЛИЦА 1. Влияние кукурбитурилов на субпопуляционный состав лимфоцитов в периферической крови лабораторных животных
TABLE 1. Effect of cucurbiturils on the subpopulation composition of lymphocytes in the peripheral blood of laboratory animals
PBS | CB[6] | CB[7] | CB[8] | |
CD3+ | 54,50±4,67% | 42,90±5,25%* | 54,50±3,33 | 58,20±3,87% |
CD19+ | 32,80±3,58% | 50,10±5,86%* | 37,60±3,34% | 30,10±3,04% |
CD16+ | 4,70±0,91% | 5,00±0,67% | 4,18±0,76% | 4,80±1,77% |
Примечание. * – достоверные различия по сравнению с PBS.
Note. *, significant differences compared to PBS.
Известно, что мыши линии BALB/c более склонны к развитию гуморального иммунного ответа [11], поэтому подобное увеличение доли B-лимфоцитов также может быть связано с особенностью реагирования данной линии животных. Однако поскольку CB[7] и CB[8] подобного эффекта в виде увеличения доли В-лимфоцитов не оказывали, можно предположить, что CB[6] способен активировать гуморальный иммунитет в условиях in vivo. Ранее в условиях in vitro было продемонстрировано, что СB[6] способен влиять на гуморальный иммунный ответ, усиливая антигенпрезентирующие свойства В-лимфоцитов [9]. Следовательно, кукурбитурилы при парентеральном введении не приводят к снижению количества иммунных клеток у лабораторных животных, но способны влиять на иммунологический баланс.
Подобные результаты могут свидетельствовать о безопасности использования кукурбитурилов в качестве систем доставки in vivo и возможности применения данных наноразмерных кавитандов для модуляции иммунного ответа при лекарственной доставке.
Выводы
Было обнаружено, что введение CB[n] не влияло на показатели крови лабораторных животных, что может свидетельствовать о безопасности данных соединений в условиях in vivo. При этом CB[6] способен оказывать стимулирующее воздействие на гуморальный иммунитет, повышая относительное количество B-лимфоцитов.
About the authors
Ekaterina A. Pashkina
Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology
Author for correspondence.
Email: pashkina.e.a@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4912-5512
PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Clinical Immunopathology
Russian Federation, NovosibirskAlina A. Aktanova
Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology
Email: aktanova_al@mail.ru
Junior Research Associate, Laboratory of Clinical Immunopathology
Russian Federation, NovosibirskEkaterina A. Kovalenko
A. Nikolaev Institute of Inorganic Chemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences
Email: e.a.kovalenko@niic.nsc.ru
PhD (Chemistry), Research Associate, Laboratory of Chemistry of Cluster and Supramolecular Compounds
Russian Federation, NovosibirskVladimir A. Kozlov
Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology
Email: vakoz40@yandex.ru
PhD, MD (Medicine), Professor, Full Member, Russian Academy of Sciences, Scientific Supervisor
Russian Federation, NovosibirskReferences
- Aktanova A., Abramova T., Pashkina E., Boeva O., Grishina L., Kovalenko E., Kozlov V. Assessment of the biocompatibility of cucurbiturils in blood cells. Nanomaterials (Basel), 2021, Vol. 11, no. 6, 1356. doi: 10.3390/nano11061356.
- Aktanova A.A., Boeva O.S., Barkovskaya M.S., Kovalenko E.A., Pashkina E.A. Influence of cucurbiturils on the production of reactive oxygen species by T and B lymphocytes, platelets and red blood cells. Int. J. Mol. Sci., 2023, Vol. 24, no. 2, 1441. doi: 10.3390/ijms24021441.
- Barooah N., Mohanty J., Bhasikuttan A.C. Cucurbituril-based supramolecular assemblies: prospective on drug delivery, sensing, separation, and catalytic applications. Langmuir, 2022, Vol. 38, no. 20, pp. 6249-6264.
- Chen H., Chan J.Y.W., Yang X., Wyman I.W., Macartney D.H., Bardelang D., Lee S.M.Y., Wang R. Developmental and organspecific toxicity of cucurbit[7]uril: In vivo study on zebrafish models. RSC Adv., 2015, Vol. 5, pp. 30067-30074.
- Das D., Assaf K.I., Nau W.M. Applications of cucurbiturils in medicinal chemistry and chemical biology. Front. Chem., 2019, Vol. 7, 619. doi: 10.3389/fchem.2019.00619.
- Hettiarachchi G., Nguyen D., Wu J., Lucas D., Ma D., Isaacs L., Briken V. Toxicology and drug delivery by cucurbit[n]uril type molecular containers. PLoS One, 2010, Vol. 5, no. 5, e10514. doi: 10.1371/journal.pone.0010514.
- Jeon Y.J., Kim S.Y., Ko Y.H., Sakamoto S., Yamaguchi K., Kim K. Novel molecular drug carrier: Encapsulation of oxaliplatin in cucurbit[7]uril and its effects on stability and reactivity of the drug. Org. Biomol. Chem., 2005, Vol. 3, pp. 2122-2125.
- Oun R., Floriano R.S., Isaacs L., Rowana E.G., Wheate N.J. The ex vivo neurotoxic, myotoxic and cardiotoxic activity of cucurbiturilbased macrocyclic drug delivery vehicles. Toxicol. Res., 2014, Vol. 3, pp. 447-455.
- Pashkina E., Aktanova A., Blinova E., Mirzaeva I., Kovalenko E., Knauer N., Ermakov A., Kozlov V. Evaluation of the immunosafety of cucurbit[n]uril on peripheral blood mononuclear cells In Vitro. Molecules, 2020, Vol. 25, no. 15, 3388. doi: 10.3390/molecules25153388.
- Pejchal J., Jošt P., Múčková L., Andrýs R., Lísa M., Zdarova Karasova J. A systematic evaluation of the cucurbit[7]uril pharmacokinetics and toxicity after a single dose and short-term repeated administration in mice. Arch. Toxicol., 2022, Vol. 96, no. 5, pp. 1411-1421.
- Pinchuk L.M., Filipov N.M. Differential effects of age on circulating and splenic leukocyte populations in C57BL/6 and BALB/c male mice. Immun. Ageing, 2008, Vol. 5, 1. doi: 10.1186/1742-4933-5-1.
- Uzunova V.D., Cullinane C., Brix K., Nau W.M., Day A.I. Toxicity of cucurbit[7]uril and cucurbit[8]uril: An exploratory in vitro and in vivo study. Org. Biomol. Chem., 2010, Vol. 8, pp. 2037-2042.
Supplementary files
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).