Том 24, № 3 (2021)

На сегодня не существует четкого представления о молекулярных участниках, обеспечивающих цитотоксическую и/или цитостатическую активность нейтрофилов (Нф) по отношению к опухолевым клеткам. Продуцируемые нейтрофилами цитокины необходимы для паракринного и аутокринного взаимодействия их с окружающими клетками. С целью оценки влияния регуляторных нейтрофилокинов на морфофункциональное состояние циркулирующих Нф при доброкачественных опухолях и раке яичников методом иммуноферментного анализа оценивали в нейтрофилах уровень IL-4, IL-6, IL-10, IL-8, IL-18, IFNγ, MCP-1, MMP-1, экспрессию CD11b, CD63, CD16, CD95. Определяли ригидность мембраны и способность нейтрофилов к образованию NET. Статистическую обработку полученных данных проводили с использование ПО Statistica 13.0, Jamovi 1.6.5.0. Установлено, что при РЯ ригидность нейтрофилов зависит от уровня в нейтрофилах IL-10, MCP-1, IL-18, IL-8, IL-4, IFNγ, IL-6. Методом множественной регрессии выявлена зависимость способности образовывать NET от уровня IL-4 и IL-6 в Нф. Выявлена обратная корреляционная связь между ригидностью мембраны Нф и их способностью образовывать ловушки при раке яичников. При доброкачественной опухоли яичников выявлена заметная прямая корреляционная связь ригидности мембраны нейтрофилов с адгезионным маркером CD11b. При раке яичников выявлена корреляционная связь ригидности мембраны Нф с маркером дегрануляции CD63. При доброкачественной опухоли яичников корреляционных связей между количеством активированных нейтрофилов и уровнем внутриклеточных цитокинов в Нф не обнаружено. При раке яичников выявлены корреляционные связи между количеством CD11b+Нф и уровнем в них IL-6, IL-8; между количеством CD63, CD95 и внутриклеточным IL-8. Количество CD16+Нф коррелировало с уровнем MMP-1 и IL-8, а CD95+Нф коррелировало с уровнем IL-18 в Нф. Таким образом, изменение уровня нейтрофилокинов при доброкачественной опухоли яичников не коррелировало с изменениями способности к NETозу, экспрессии активационных маркеров, но сопровождалось увеличением ригидности мембраны циркулирующих нейтрофилов. При раке яичников повышение IL-8 коррелировало со снижением экспрессии CD16 и повышением CD63; снижение CD16 коррелировало с возрастанием MMP-1. Повышение ригидности мембраны при раке яичников ассоциировалось с изменениями всех рассмотренных нейтрофилокинов (IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, MCP-1, IFNγ). Комбинация показателей IL-4, IL-6, IL-18, числа NET и ригидности мембраны циркулирующих Нф (по результатам мультивариантного анализа) может быть использована для дифференциальной диагностики рака яичника.

Высокий уровень рождения детей с врожденными пороками сердца (ВПС) и существенный вклад этой патологии в формирование перинатальной, младенческой и детской смертности, а также уровень инвалидизации детей, в том числе после радикального хирургического лечения, определяют значимость поиска методов прогнозирования и профилактики риска формирования ВПС на этапе планирования беременности. Одной из ключевых молекул, участвующей в иммунных взаимодействиях материнского микроокружения с эмбрионом, является HLA-G. Известно, что наибольшее количество антител к антигенам HLA различных классов выявляется у многорожавших женщин. Остается открытым вопрос, через какие молекулы HLA реализуется эффект блокирования иммунного воспаления в системе «мать – эмбрион» – женские антитела или донорский иммуноглобулин. Целью исследования было получение очищенного гамма-глобулинового препарата из крови многорожавших женщин и оценка его функциональной активности в отношении женских молекул HLA-G.
Гамма-глобулиновую фракцию (ГГФ) из крови многорожавших женщин получали с помощью аффинной хроматографии на системе DEAE Affi-Gel Blue (BioRad, США). Были сформированы две группы: контрольная группа из 14 здоровых мужчин и опытная из 14 женщин, имеющих детей с врожденными пороками сердца. Особенности изменения экспрессии HLA-G на лимфоцитах под воздействием ГГФ были оценены с помощью протокола проточной цитофлуориметрии с расчетом соответствующих коэффициентов в процентах. Оценка функциональной активности концентрированной ГГФ показала, что в контрольной группе под ее воздействием подавлялась экспрессия HLA-G на CD3 положительных и отрицательных лимфоцитах по отношению к действию аутосыворотки. В основной группе эффект ГГФ на экспрессию HLA-G был разнонаправленным. Так, на лимфоцитах CD3 отрицательных ГГФ значимо подавляла экспрессию мембранной молекулы HLA-G при сравнении с контрольной группой. В то же время по отношению к лимфоцитам CD3+ ГГФ оказывала стимулирующий эффект или не оказывала блокирующего эффекта. Полученный препарат может быть прототипом иммуноглобулина для внутривенного введения. Кроме того, в дальнейшем можно будет использовать подобные иммуноглобулиновые препараты для иммунной профилактики несиндромальных спорадических ВПС на прегравидарном этапе, так и для лечения в ранние сроки беременности. Лечебный эффект будет заключаться в блокировании свободных для распознавания HLA-молекул эмбриобласта.

Изучали связь материнского полиморфизма гена HLA-G, внутриматочной инфекции с риском врожденных пороков развития у ребенка. Исследуемую группу (группа ВПР) составили 331 матерей с диагнозом у плода/новорожденного – ВПР. Из них на момент обследования 225 (68%) женщин были беременными (15-35 недель), а 106 (32%) – роженицы детей с ВПР. Диагноз ВПР плода устанавливался ультразвуковым исследованием (УЗИ) и подтверждался повторно в разные сроки пренатального периода. Постановка клинического диагноза у новорожденных осуществлялась неонатологами в соответствии с МКБ-10 (Q00-Q99). Критерием исключения были ВПР, ассоциированные с анеуплоидией и с сахарным диабетом у матери. Группу сравнения (контроль) составили 408 матерей без ВПР у плода/ребенка, из них 264 (65%) были беременными (15-36 нед.) и ранее имели 1-2 детей, 144 (35%) – роженицами доношенных и недоношенных I степени детей (родились в сроки 35-40 недель с массой тела больше 2000 г). Данные о внутриутробной инфекции у матери во время беременности были получены из медицинских карт обследуемых женщин. Учитывались результаты лабораторных тестов: микроскопического исследования (для выявления бактериального вагиноза и вульво-вагинального кандидоза); иммуноферментного анализа и полимеразно-цепной реакции (выявление генитального герпеса, цитомегаловируса, вируса папиломы человека (ВПЧ) типа 16/18; Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum и Gardnerella vaginalis; Trichomonas vaginalis и Toxoplasma gondii). Типирование однонуклеотидных замен (SNP) Thr31Ser (rs41551813) в экзоне 2, Leu110Ile (rs12722477) и 1597 delС (rs41557518) в экзоне 3 гена HLA-G проводили методом асимметричной ПЦР. Наше исследование показало, что возраст матери не оказывал значимого влияния на риск ВПР у плода/новорожденного. В то же время внутриматочная инфекция у матерей была значимым фактором риска ВПР у детей (OR = 1,57 (1,08-2,29); p = 0,002). Выявлена значимая ассоциация материнского аллеля 110 Ile (HLA-G*01:04) c риском ВПР у плода/новорожденного (OR = 1,57 (1,08-2,29), p = 0,01). Полиморфные локусы rs41551813 и rs41557518 гена HLA-G у матери значимо не влияли на риск ВПР у ребенка. Полученные нами результаты демонстрируют, что внутриматочная инфекция и аллель 110Ile (HLA-G*01:04) у матери могут выступать факторами риска ВПР у ребенка. 

Многочисленные данные об иммуномодулирующем потенциале семенной плазмы (СП), полученные на животных, явились теоретическим обоснованием использования СП для повышения эффективности имплантации эмбриона у человека и стимулировали попытки введения СП в репродуктивный тракт женщины для повышения эффективности программы ЭКО. Однако, несмотря на многочисленные исследования, подтвердить положительное влияние СП на имплантацию у человека не удалось. Мы предполагаем, что благоприятное влияние семенной плазмы на наступление беременности у женщин, имевших контакт с СП своих половых партнеров во время цикла экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) / интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ), может быть реализовано при сбалансированном содержании про- и противовоспалительных цитокинов в СП. Однако устоявшаяся парадигма благоприятного влияния СП на имплантацию эмбриона, сформированная на основании экспериментов на животных, не учитывает возможность патологических изменений СП у человека под влиянием неблагоприятных факторов окружающей среды, неправильного образа жизни, психоэмоционального стресса у мужчин репродуктивного возраста, вступающих в программу ЭКО. Нельзя исключить, что неблагоприятные внешние воздействия могут приводить к дисбалансу цитокинов в СП и отрицательно сказываться на успехе программ ЭКО/ИКСИ.
Цель – определить, существует ли корреляция между содержанием цитокинов IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-18, IFNγ, TNFα, TNFβ и TGF-β1 в СП и наступлением беременности у пациенток, контактировавших с семенной плазмой во время цикла ЭКО/ИКСИ. Двадцать восемь пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, вступающие в протоколы ЭКО/ИКСИ, контактировали с СП при половых контактах в период, предшествовавший дню забора яйцеклеток в протоколах ЭКО/ИКСИ, а также при интравагинальном введении СП сразу после трансвагинальной пункции. Количественное измерение цитокинов в СП, полученной в день забора яйцеклеток и используемой для дополнительного интравагинального введения в этот день, проводили с помощью технологии FlowCytomix™.
Концентрации IL-1, IL-18 и TNFβ были значительно выше в СП половых партнеров небеременных пациенток (p = 0,011; p = 0,030 и p = 0,008 соответственно). Общее содержание IL-2, IL-6, IL-18 и TNFβ в эякуляте также было достоверно выше у половых партнеров небеременных пациенток (p = 0,020; р = 0,042; р = 0,030 и р = 0,004 соответственно).
Повышенные концентрации провоспалительных цитокинов в СП, а также их чрезмерное общее содержание в эякуляте, могут отрицательно сказаться на имплантации эмбриона и наступлении беременности. Полученные нами данные о повышении содержания провоспалительных цитокинов в СП пациентов в группе с отсутствием беременности могут свидетельствовать о возможных стрессзависимых изменениях состава СП у значительной части пациентов.

В настоящее время наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) признан одной из самых частых патологий у женщин репродуктивного возраста. Наружный генитальный эндометриоз является хроническим заболеванием, поражающем около 10% женщин репродуктивного возраста, приводя к функциональным и структурным изменениям в репродуктивной системе, бесплодию, тазовой боли, снижая качество жизни пациенток. Кроме того, пациентки с эндометриозом нередко страдают депрессией, частота которой особенно высока при наличии боли. При эндометриозе наблюдается дизрегуляция ответа Т-клеточного звена иммунитета, которая заключается в нарушении взаимодействий Т-клеток, макрофагов, NK (натуральных киллеров), В-клеток, позволяющая клеткам эндометрия имплантироваться в эктопических местах. Выраженное негативное влияние НГЭ на качество жизни больных, их репродуктивную функцию, нарушение адаптации больных в обществе, растущие затраты на лечение определяют социальное значение заболевания и важность его изучения. На сегодняшний день очевидно, что в формировании НГЭ значительную роль играют нарушения иммунной системы, однако несмотря на обширные исследования в этой области, недостаточно изучены процессы апоптоза при НГЭ.
В этой связи целью исследования явилось изучение характера нарушений процессов апоптоза у женщин с I-II и III-IV стадиями наружного генитального эндометриоза.
Было обследована 71 пациентка с НГЭ, которые были подразделены на 2 группы: 1-я группа – пациентки с I-II стадией НГЭ (n = 31) и 2-я группа – пациентки с III-IVстадией НГЭ (n = 40), в контрольную группу вошли 24 пациентки без НГЭ.
Определение популяционного состава лимфоцитов периферической крови проводили методом лазерной проточной цитометрии, используя реагенты фирмы Immunotex, FITC меченые СD8+, CD16+ и PE-меченые СD95+. Количество лимфоцитов, вступивших в апоптоз, выявляли с использованием диагностического набора, включающего AnnexinV+ (FITC) и PI+ фирмы Сaltag. Результаты учитывали на проточном цитометре BECKMAN COULTER EPICS XL-II, используя стандартные протоколы.
Значимыми причинами НГЭ является дисбаланс процессов активации и апоптоза иммунокомпетентных клеток. Индукция апоптоза по пути Fas-FasL у пациенток с наружным генитальным эндометриозом приводит к снижению цитотоксичности, опосредованной Т-лимфоцитами и NK-клетками.
Статистически значимое снижение содержания АnnexinV+ презентирующих лимфоцитов свидетельствует о нарушении реализации их рецептор-зависимого апоптоза. Нарушение процессов апоптоза может быть ответственным за развитие НГЭ, способствуя пролиферации и росту эндометриоидных имплантатов.

Разработка эффективных способов предикции, диагностики и терапии органов женской репродуктивной системы является актуальной задачей. Большой интерес как в диагностическом, так и терапевтическом аспектах представляют естественные антигликановые антитела (АГАТ), т.к. АГАТ очень разнообразны, а их специфичность отобрана в ходе эволюции. В данной работе исследована возможность использования метода гликоэррея, а также сигнатурного подхода для предсказания эффективности проводимой терапии при раке молочной железы (РМЖ), а также целенаправленному поиску естественных антител с терапевтическим потенциалом.
Объектом исследования явилась сыворотка периферической крови условно здоровых доноров – женщин (n = 27) и пациентов с установленным диагнозом метастатический РМЖ перед началом проведения терапии (n = 29). Медианный возраст пациентов составил 48 лет. Медианный возраст здоровых составил 50 лет. Пациентки получали лечение сочетанной терапией доксирубицином и герцептином с разным исходом: 11 пациенток не ответили на лечение и 18 пациенток ответили (опухоль не диагностировалась). Для исследования АГАТ использовали гликоэррей, на котором напечатано более 200 различных гликанов. Связавшиеся с лигандами антитела детектировали с помощью Ig(G+M+А)-biot. Для поиска комбинации диагностически значимых АГАТ (сигнатуры) использовали разработанный ранее математический аппарат «Иммунорулер».
Исследована возможность использования гликоэррея для предсказания эффективности терапии на примере РМЖ. В исследование вошли пациентки, получавшие сочетанную терапию доксирубицином и герцептином, результат которой отслеживали по прошествии 18-24 недель. Оказалось, что сигнатура, состоящая из 10 АГАТ, с высокой чувствительностью и специфичностью (90 и 91% соответственно), позволяет предсказать эффективность назначенной терапии.
Подтверждена возможность диагностики РМЖ с использованием АГАТ. В уточненную сигнатуру вошло 5 антител: уровень двух АГАТ был значимо выше у пациентов, чем у доноров, и это, повидимому, адаптивные антитела, появившиеся в ответ на возникшую патологию. Для трех других антител сигналы у пациентов ниже, чем у здоровых индивидуумов, что может свидетельствовать об истощении гуморального звена иммунитета при развитии РМЖ. Т.е. такие АГАТ могут обладать терапевтическим потенциалом, и, благодаря использованию скрининговой технологии гликоэррея, их можно искать целенаправленно. 

Одним из новых трендов в изучении патогенеза преэклампсии (ПЭ) является исследование развития гликопатологии в функциональной системе мать-плацента-плод. Учитывая важность углевод-белковых взаимодействий для морфогенеза плаценты, взаимодействий в иммунной системе, формирования толерантности к аллоантигенам плода, особую роль в патогенезе ПЭ могут иметь антигликановые антитела (АгАт), которые способны вмешиваться в эти взаимодействия, изменяя их. Поскольку продукция антител происходит на фоне имеющихся естественных антител, а также адаптивных, приобретенных в течение жизни, очевидно, что имеется значительное число факторов, которые находятся во взаимосвязи с АгАт, что имеет значение для патогенеза и выявления факторов риска заболевания. Цель исследования – определение взаимосвязи между содержанием АгАт в крови и клинико-лабораторными параметрами у пациенток с физиологической беременностью и ПЭ.
В исследование включены 146 беременных: основную группу I составила 51 пациентка с умеренной ПЭ, группу сравнения – 95 условно здоровых беременных. Изучены клинико-анамнестические данные, особенности течения беременности, данные лабораторных обследований, данные представительного спектра АгАт. АгАт (IgG и IgM) исследовались в сыворотке крови с помощью гликочипа, содержащего 473 гликана и 216 полисахаридов. Для определения связи между переменными были использованы непараметрический метод ранговой корреляции по Спирмену для анализа количественных данных, и Т-критерий Вилкоксона для анализа качественных данных. Установлено, что в основной группе выявляется больше корреляционных связей между уровнем АгАт различных специфичностей и клинико-лабораторными параметрами, чем в группе сравнения.
Отягощенный гинекологический и инфекционный анамнез, осложнения во время беременности ассоциированы с изменениями профиля АгАт обоих классов у пациенток, беременность которых осложнена умеренной ПЭ, что свидетельствует о патогенетическом значении этих антител. У здоровых беременных уровень антител к ряду гликанов реципрокно связан с количеством лимфоцитов, тромбоцитов и АЛТ, что может свидетельствовать о регуляторной роли этих антител, поскольку лимфоцитоз, тромбоцитопения и повышение трансаминаз в крови относятся к патологическим состояниям.
Выявленные взаимосвязи между уровнем АгАт и клинико-анамнестическими и лабораторными параметрами свидетельствуют о различных паттернах корреляционных взаимосвязей в норме и при патологии, что, по-видимому, указывает на патогенетическое значение АгАт ряда специфичностей при ПЭ, и их регуляторную роль при нормальной беременности.