First experience in usage of lipoaspirate-derived mesenchymal stromal cells in combined treatment of the patients with liver cirrhosis

Full Text

Работа выполнена за счет средств федерального бюджета на проведение фундаментальных и поисковых научных исследований (№ гос. регистрации в ЕГИСУ НИОКТР 122011800324-4 и 122012000367-6 соответственно).

Введение

Цирроз печени (ЦП) представляет исход хронических диффузных заболеваний печени и является серьезной проблемой в плане медикаментозного лечения. Единственным эффективным методом лечения декомпенсированных форм ЦП является трансплантация печени. Однако дефицит донорских органов, необходимость длительной иммуносупрессии и высокая стоимость лечения существенно ограничивают возможности данного подхода и побуждают искать альтернативные пути. В этом направлении большой интерес представляют клеточные технологии, основанные на использовании стволовых клеток, в частности мезенхимальных стромальных клеток (МСК), которые наряду со способностью к самоподдержанию и дифференцировке в клетки мезенхимального направления, способны дифференцироваться в гепатоцитоподобные клетки in vivo и in vitro и оказывать стимулирующий эффект на регенерацию гепатоцитов [1, 12]. Кроме того, МСК подавляют активность воспалительного процесса в тканях, препятствуя тем самым прогрессии фиброза [3]. Терапевтическая эффективность костномозговых МСК у пациентов ЦП показана в ряде клинических испытаний [5, 6]. Проведенные нами клинические испытания также показали безопасность и эффективность клеточной терапии, включающей использование костномозговых МСК, в комплексном лечении больных ЦП [10].

Поскольку пролиферативный потенциал МСК костного мозга ограничен и снижается с возрастом [2], в последние годы наблюдается рост числа клинических исследований с использованием МСК, выделенных из жировой ткани. Подобно костномозговым аналогам, МСК жировой ткани характеризуются выраженным противовоспалительным и регенераторным потенциалом, при этом отличаются более высокой пролиферативной активностью, низким коэффициентом старения и генетической стабильностью при культивировании ex vivo [11]. Использование жировой ткани в качестве источника МСК представляется более предпочтительным у пациентов с высоким индексом массы тела, а также при наличии тяжелых сопутствующих заболеваний (тяжелая сердечная недостаточность, некомпенсированный сахарный диабет).

Учитывая вышесказанное, нами было инициировано поисковое научное исследование, целью которого стала оценка безопасности и переносимости аутологичной трансплантации МСК, полученных из жировой ткани (липоаспирата), в комплексном лечении больных ЦП различного генеза.

Материалы и методы

В исследование последовательно отбирались пациенты с ЦП различной этиологии (обоего пола, в возрасте от 18 до 70 лет), проходившие обследование и лечение на базе иммунологического отделения клиники иммунопатологии НИИФКИ в период с начала 2020 г. по февраль 2022 г. Диагноз «ЦП» базировался на данных гистологического исследования, а также комплекса клинических, лабораторных и радиологических данных у пациентов с явными признаками портальной гипертензии. Критериями невключения являлось одновременное участие в другом клиническом исследовании, несоответствие критериям включения, активный алкоголизм и/или употребление наркотических средств, ВИЧ-инфекция, декомпенсированные заболевания легких и сердца, кровотечение из варикозно расширенных вен пищевода, наличие гепатоцеллюлярной карциномы или других онкологических заболеваний, в том числе в анамнезе, острые инфекции, тромбоцитопения ниже 50 × 10⁹/л, психические нарушения, беременность, неспособность пациента подписать информированное согласие. Степень тяжести ЦП оценивали по шкалам Child-Pugh и MELD.

Жировую ткань (липоаспират) получали при проведении операции липосакции под местной анестезией в условиях хирургической операционной. Липоаспират подвергали ферментативной диссоциации с помощью 0,1% раствора коллагеназы 1А типа (Sigma-Aldrich) в течение 45 мин при 37 °С с последующей инактивацией фермента физиологическим раствором. Нерасщепленные фрагменты жировой ткани удаляли фильтрованием через нейлоновые фильтры (размер пор 100 μm). Из полученных таким образом ядросодержащих клеток стромально-васкулярной фракции стандартно генерировали мезенхимальные стромальные клетки (МСК) в течение 14 дней. По достижении 80-90% слияния клетки аккуратно снимали с поверхности культурального флакона, используя стерильный апирогенный скребок для культур клеток, отмывали и вводили внутривенно капельно в 50 мл физиологического раствора.

Клинико-лабораторное обследование пациентов (включая общий и биохимический анализы крови, оценку по шкале Child-Pugh и MELD) проводили до начала терапии с мониторингом состояния больных через 6-12 месяцев после окончания лечения.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0. Данные представлены в виде медианных значений (Ме) и квартильного диапазона (Q_0,25-Q_0,75). Для выявления значимых различий сравниваемых показателей использовали непараметрические критерии: U-критерий Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

Исследуемую группу составили 12 пациентов – 4 мужчины и 8 женщин, в возрасте от 33 до 67 лет (табл. 1). В половине случае развитие ЦП было обусловлено вирусными гепатитами (n = 6), в половине – факторами невирусного генеза, включая токсические (преимущественно алкогольные) воздействия (n = 3), первичный биллиарный цирроз (ПБЦ, n = 2) и криптогенный ЦП (n = 1). Степень тяжести ЦП, оцениваемая по шкале Child-Pugh, соответствовала прогностическому классу А – у 6 пациентов (50%), классу В – у 6 (50%) пациентов. Балл по шкале MELD составил 9,0 (Ме; 8-11), причем у четырех пациентов балл MELD составлял 11 и более, что свидетельствовало о декомпенсированном ЦП. Две трети пациентов после лечения перенесли новую коронавирусную инфекцию разной степени тяжести.

 

Таблица 1. Характеристика пациентов, включенных в исследование / Table 1. Characteristics of patients included in the study

Возраст, Me (min-max), лет Age, Me (min-max), years	51,5 (33-67)
Пол (М/Ж) Sex (M/F)	4/8
Этиология ЦП: Etiology of CP: 1) вирусный, n (%): 1) viral, n (%): – HCV, n (%) – HBV ± HDV, n (%) 2) невирусный, n (%) 2) non-viral, n (%): – токсический, n (%) – toxic, n (%) – первичный билиарный цирроз, n (%) – primary biliary cirrhosis, n (%) – криптогенный, n (%) – cryptogenic, n (%)	6/12 (50%) 4/12 (33,3%) 2/12 (16,37%) 6/12 (50%) 3/12 (33,33%) 2/12 (16,67%) 1/12 (8,33%)
Child-Pugh, Ме (Q0,25-Q0,75): – класс А, n (%) – class A, n (%) – класс В, n (%) – class В, n (%)	6/12 (50%) 6/12 (50%)
MELD, Ме (Q0,25-Q0,75)	9,0 (8,0-11,5)
COVID, n (%)	8/12 (66,67%)

 

Всем пациентам однократно вводили аутологичные мезенхимальные стромальные клетки (МСК, 12,94 × 10⁶, 11,3-16,0 × 10⁶), полученные в результате культивирования ядросодержащих клеток липоаспирата пациента в течение 14 дней. Данная популяция содержала 85-95% клеток, экспрессирующих специфичные для МСК маркеры (CD73, CD90, CD105), и минимальное количество клеток, экспрессирующих «линейные» маркеры CD3 (3,9±1,55%), CD20 (5,3±1,30%), CD16 (5,6±1,72%), CD14 (5,6±2,28%), HLA-DR (1,1±0,57%), а также маркер гемопоэтических клеток CD34 (0,69±0,28%).

Ни проведение липоаспирации, ни введение МСК не сопровождалось развитием побочных эффектов и серьезных нежелательный явлений. Пациенты отмечали незначительную болезненность передней брюшной стенки после проведенной липоаспирации, а также кратковременные повышения температуры тела до субфебрильных цифр (не более 37,5). Сравнительный анализ параметров периферической крови до и через 3 дня после введения клеток также не выявил статистических различий по большинству исследуемых показателей (данные не представлены).

Анализ клинической эффективности, проведенный через 6-12 мес. после терапии, позволил выделить две подгруппы: ответившие (подгруппа 1) и неответившие (подгруппа 2) на терапию (табл. 2). Критерием ответа являлось уменьшение/стабилизация прогностического балла по шкале MELD. В подгруппу 1 вошли 6 пациентов (у 4 балл по MELD снизился, у 2 – не изменился), подгруппу 2 составили 6 пациентов, у которых балл по MELD увеличился. Обе подгруппы не различались по этиологии и тяжести ЦП, сопутствующей патологии (COVID) (p > 0,05), в то же время ответившие на терапию пациенты были старше. Исходно пациенты не различались по показателю MELD, однако через 6-12 мес. после терапии у пациентов подгруппы 2 балл по шкале MELD был выше (р = 0,055).

 

Таблица 2. Сравнительная характеристика пациентов с наличием / отсутствием ответа на терапию / Table 2. Comparative characteristics of patients with / without response to therapy

	Ответившие Responders (n = 6)	Неответившие Non-responders (n = 6)	Уровень значимости (р) p-value
Возраст, Ме (Q0,25-Q0,75) Age, Ме (Q0,25-Q0,75)	55,5 (52-59)	48 (44-51)	0,044
Пол (М/Ж) Sex (M/F)	3/3	1/5	0,22
Этиология (n, %): Etiology (n,%): – вирусные – viral – невирусные – non-viral	3/6 (50%) 3/6 (50 %)	3/6 (50%) 3/6 (50 %)	1,0 1,0
Класс А (n, %) Class A (n, %)	3/6 (50%)	3/6 (50%)	1,0
Класс В (n, %) Class B (n, %)	3/6 (50%)	3/6 (50 %)	1,0
MELD, Ме (Q0,25-Q0,75) – до лечения – before treatment – после лечения – after treatment	9 (8-11) 8,5 (7-9)	9,5 (8-13) 11,5 (9-16)	0,81 p = 0,055
COVID (n, %)	4/6	4/6	p = 1,0

 

У четырех ответивших на терапию пациентов этиологическими факторами ЦП были алкогольное поражение печени (n = 1), ПБЦ (n = 1), хронический вирусный гепатит С (n = 2). Положительная динамика в этой подгруппе выявлялась по синдромам печеночно-клеточной недостаточности (n = 1), цитолиза (n = 2), холестаза (n = 1). У двух пациентов со стабилизацией балла по MELD (генез ЦП – хронический вирусный гепатит В и ПБЦ) отмечалась стабилизация показателей в пределах референсных значений.

В группе пациентов, не ответивших на терапию, генез ЦП был вирусным (хронический вирусный гепатит С, n = 2, и В, n = 1), алкогольным (n = 2) и невыясненным (криптогеный ЦП, n = 1). Увеличение прогностического балла по MELD в этой подгруппе ассоциировалось с усилением синдрома холестаза (n = 3), цитолиза (n = 3) и печеночно-клеточной недостаточности (n = 3).

Отметим, что данное клиническое исследование проводилось в период пандемии COVID-19. После терапии МСК большинство рекрутированных пациентов (8/12) перенесли новую коронавирусную инфекцию разной степени тяжести, причем частота заболеваемости была совершенно одинаковой в группах с наличием или отсутствием ответа на терапию МСК (4/6 в каждой группе). Один пациент со стабилизацией состояния по ЦП умер впоследствии от осложнений COVID-19.

Первые сообщения об экспериментальном использовании МСК, выделенных из жировой ткани, в модели фиброза печени появились сравнительно недавно. В 2017 г. две группы исследователей сообщили о сравнимом противовоспалительном и антифибротическом эффекте МСК костного мозга и жировой ткани в модели CCl4-индуцированного фиброза печени у мышей [7] и крыс [4], а также о более выраженном антипролиферативном и проапоптогенном эффекте МСК жировой ткани в отношении звездчатых клеток печени [4].

В литературе имеются также единичные сообщения об использовании МСК жировой ткани у человека. Имеются результаты проведенного в 2017 г. исследования эффективности свежевыделенных стволовых клеток липоаспирата, выделенных с использованием системы Celution [8]. Авторы сообщают об отсутствии серьезных нежелательных явлений у четырех рекрутированных пациентов в течение месяца после терапии. У 3 из 4 пациентов концентрация сывороточного альбумина оставалась неизменной или повышалась в течение 6 мес., оставаясь на достигнутом уровне до 12 мес. у одного пациента. Через 24 часа после введения клеток повышался уровень факторов, связанных с регенерацией печени (фактор роста гепатоцитов и интерлейкин-6). В отличие от нашего подхода, в этом исследовании были использованы свежевыделенные клетки жировой ткани.

В 2021 году опубликованы результаты многоцентрового клинического испытания стволовых клеток, полученных из аутологичной жировой ткани, у 7 пациентов с неалкогольным стеатогепатитом и жировой дистрофией печени [9]. В отличие от используемого нами внутривенного введения генерированных МСК, в данном исследовании использовали свежевыделенные клетки, которые вводились через печеночную артерию. Авторы сообщили об отсутствии каких-либо нежелательных явлений. Через 24 недели у большинства пациентов улучшилась концентрация сывороточного альбумина (у 6/7) и протромбиновая активность (у 5/7).

Особенностью нашего исследования является его проведение в период пандемии COVID-19, и две трети пациентов после терапии МСК перенесли новую коронавирусную инфекцию разной степени тяжести. Важно, что такие пациенты были как в группе ответивших на терапию МСК, так и среди неответивших. Согласно последним данным, у пациентов с циррозом и хроническими заболеваниями печени общий уровень смертности может достигать 40% после заражения COVID-19, что значительно превышает показатели смертности при этом заболевании. В нашем исследовании зарегистрирован единственный летальный исход, что составляет 12,5%. Эти данные позволяют предположить, что новая коронавирусная инфекция не вызывает ухудшение функции печени при ЦП.

Заключение

Таким образом, результаты проведенного нами исследования свидетельствуют о том, что применение МСК, выделенных из жировой ткани пациентов с циррозом печени, является безопасным и потенциально перспективным для стабилизации или улучшения функции печени.

About the authors

Olga I. Zheltova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: olzheltova@mail.ru

PhD (Medicine), Allergist-Immunologist, Department of Immunopathology, Clinic of Immunopathology

Russian Federation, 14, Yadrintsevskaya str., Novosibirsk, 630091

Yekaterina Ya. Shevela

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Author for correspondence.
Email: shevelak@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8997-3586

PhD, MD (Medicine), Leading Research Associate, Laboratory of Cellular Immunopathology

Russian Federation, 14, Yadrintsevskaya str., Novosibirsk, 630091

Ilona V. Meledina

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: ilonameledina@gmail.com

PhD (Medicine), Head, Department of Immunopathology, Clinic of Immunopathology

Russian Federation, 14, Yadrintsevskaya str., Novosibirsk, 630091

Elena R. Chernykh

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: ct_lab@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Head, Laboratory of Cellular Immunopathology

Russian Federation, 14, Yadrintsevskaya str., Novosibirsk, 630091

References

Supplementary files