Comparative assessment of genetic polymorphism of Toll-like 2 and 6 receptors predisposing for non-specific ulcerative colitis and irritable bowel syndrome in Russians from Chelyabinsk Region

Full Text

Введение

Система Toll-подобных рецепторов (TLRs) является, в настоящее время, одной из наиболее изучаемых регуляторных систем. Хорошо известно, что TLRs узнают патоген-ассоциированные образы патогенности (PAMPs) микроорганизмов и инициируют каскад иммунных реакций [1]. Ведущая роль в процессах распознавания PAMPs принадлежит TLR2, TLR4. Особенностью функционирования TLR2 является способность формировать гетеродимеры с TLR1 и TLR6, что необходимо для расширения спектра лигандов и активации макрофагов и дендритных клеток через общие сигнальные пути MyD88, TIRAP [3, 13]. Согласно литературным данным, одним из механизмов регуляции активности Toll-подобных рецепторов является генетический полиморфизм их генов, влияющий как на уровень экспрессии их генов, так и на конформацию белковых молекул рецепторов, что может приводить к изменению скорости передачи информационных сигналов и, как следствие, к нарушению функционирования некоторых сигнальных путей и выраженности воспалительных реакций, лежащих в основе иммунопатогенеза мультифакторных патологий [2, 3].

Функциональный генетический полиморфизм TLRs представлен однонуклеотидными заменами, формирующими аллельные варианты с различным действием. Ген TLR2 располагается на длинном плече четвертой хромосомы и содержит ряд однонуклеотидных полиморфизмов, среди которых хорошо изученным является генетический вариант, приводящий к замене аргинина на глутамин (Arg753Gln) в белке TLR2. Данный полиморфизм активно изучается в качестве биомаркера предрасположенности к различным инфекционным и мультифакторным заболеваниям [3], в частности к воспалительным заболеваниям кишечника [5, 6, 11, 12].

Следует отметить, что на четвертой хромосоме располагается ген еще одного Toll-подобного рецептора – TLR6, для которого наиболее известным является полиморфизм в точке C745T. Согласно литературным данным, однонуклеотидная замена цитозина на тимин в гене TLR6 (rs5743810) приводит к аминокислотной замене Pro249Ser и формирует два аллеля, распределение частот встречаемости которых сильно варьирует в популяциях различного происхождения [2], что осложняет оценку его вклада в формирование предрасположенности к различным мультифакторным заболеваниям. Однако исследований, посвященных поиску ассоциаций данного полиморфизма TLR6, в доступной литературе мало и их данные противоречивы [9].

В основе иммунопатогенеза неспецифического язвенного колита (НЯК) и синдрома раздраженного кишечника (СРК) лежит неадекватный иммунный ответ на антигены собственной микробиоты, опосредованный через Toll-подобные рецепторы, в том числе TLR2 и TLR6, чрезмерная активация которых может привести к хроническому воспалению кишечника [4]. Установлено, что при определенных клинических вариантах СРК повышается экспрессия TLR2, это приводит к увеличению продукции провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-8 клетками слизистого слоя [4]. Также у больных НЯК повышена экспрессия TLR2 дендритными клетками в слизистом слое кишечника, в результате формируется неадекватный иммунный ответ на измененную микробиоту [8].

Несмотря на то, что достаточно хорошо изучен вклад TLRs в иммунопатогенез воспалительных заболеваний кишечника, данных по роли TLR6 при СРК и НЯК в доступной литературе не найдено.

Совместное функционирование белков TLR2 и TLR6 при распознавании лигандов, а также взаимно близкое расположение их генов на 4 хромосоме позволяет рассмотреть не только отдельные SNP данных генов, но их гаплотипические сочетания в качестве потенциальных факторов риска формирования восприимчивости к различным заболеваниям.

Цель – оценка частот встречаемости аллелей, генотипов и гаплотипических сочетаний TLR2-6 и их ассоциации с предрасположенностью к неспецифическому язвенному колиту и синдрому раздраженного кишечника у русских Челябинской области.

Материалы и методы

Контингент обследуемых лиц

Выборка больных синдромом раздраженного кишечника: общее количество – 63, средний возраст на момент формирования группы – 43,4±1,6. Группа больных неспецифическим язвенным колитом состояла из 79 человек, средний возраст – 41,9±1,3. Отбор больных и верификация диагнозов проводился гастроэнтерологами г. Челябинска. Группа сравнения (113 человек; средний возраст – 34,6±0,75) представлена потенциальными донорами стволовой клетки ГБУЗ «Челябинская областная станция переливания крови».

Все обследуемые лица самоидентифицировались как русские. Популяционная принадлежность определялась согласно рекомендациям 8-го Международного Симпозиума в 1980 г. (Лос-Анджелес, США).

Основным методом исследования для генотипирования полиморфных сайтов в генах TLR2, TLR6 являлась аллель-специфическая полимеразная цепная реакция с реактивами ООО НПФ «Литех» г. Москва. Метод детекции – электрофорез в 3%-ном агарозном геле с УФ-визуализацией.

Статистическая обработка

В ходе работы установлены частоты аллелей, генотипов, гаплотипов TLR2 – TLR6. Сравнение групп больных СРК и условно здоровых лиц проводилось с использованием следующих показателей, принятых в иммуногенетических исследованиях: критерий Пирсона (χ²), χ² с поправкой Йетса, а также с помощью точного метода Фишера.

Оценка достоверности различий в распределении частот генотипов, согласно моделям наследования и соответствие закону Харди–Вайнберга, проводились с использованием онлайн-приложения SNPStats [10].

Показатели сцепления и частоты встречаемости гаплотипов TLR2-TLR6 были рассчитаны в программе Arlequin ver 3.5 [7].

Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р ≤ 0,05, незначимыми при р > 0,10, для промежуточных значений р (0,05 < р ≤ 0,10) обсуждали тенденцию к различиям.

Результаты и обсуждение

Частоты встречаемости аллелей и генотипов TLR2 во всех выборках соответствуют ожидаемым, согласно закону Харди–Вайнберга. Данные представлены в таблице 1.

Как видно из полученных результатов, в группе больных НЯК распределение аллелей и генотипов Arg753Gln TLR2 характеризуется повышением частоты аллеля с заменой за счет увеличения носителей гетерозиготного генотипа (24,05% против 9,73%). Согласно критерию отношения шансов, аллель с заменой и гетерозиготный генотип могут рассматриваться как потенциальные факторы риска формирования вероятности развития неспецифического язвенного колита у русских Челябинской области. Данные ассоциации описываются двумя моделями наследования: протективный эффект гомозиготного предкового генотипа (G/G против A/G+ A/A, р = 0,014) – доминантная модель, а формирование предрасположенности к НЯК при носительстве гетерозиготного генотипа (A/G против A/A + G/G, р = 0,0076) – сверхдоминантная модель. Распределение аллельных вариантов и генотипов Arg753Gln TLR2 не имело статистически значимых различий между группами больных СРК и условно здоровых лиц. Таким образом, данный полиморфизм не ассоциирован с предрасположенностью/устойчивостью к синдрому раздраженного кишечника у русских Челябинской области.

Оценка частот встречаемости аллелей и генотипов TLR6 в исследуемых группах показала, что у условно здоровых лиц и больных неспецифическим язвенным колитом распределение генотипов соответствует ожидаемым, тогда как в группе больных СРК имеются отклонения. Частоты встречаемости аллелей и генотипов Pro249Ser TLR6 также представлены в таблице 1.

 

ТАБЛИЦА 1. ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ АЛЛЕЛЕЙ И ГЕНОТИПОВ SNPs ГЕНОВ TLR2, TLR6 В ИССЛЕДУЕМЫХ ГРУППАХ

TABLE 1. FREQUENCIES OF ALLELES AND GENOTYPES OF SNPs OF TLR2, TLR6 GENES IN THE GROUPS

Аллели / генотипы Alleles / genotypes	Группа больных НЯК (1), % Group of patients with UC, (1), %	Группа больных СРК (2), % Group of patients with IBS, (2), %	Группа сравнения (3), % Control (3), %	Сравнение (1) – (3) χ 2, p, OR, 95% ДИ Comparison (1) – (3) χ2, p, OR, 95% CI	Сравнение (2) – (3) χ2, p, OR, 95% ДИ Comparison (2) – (3) χ2, p, OR, 95% CI
	n = 79 кол-во аллелей = 158 number of alleles = 158	n = 63 кол-во аллелей = 126 number of alleles = 126	n = 113 кол-во аллелей = 226 number of alleles = 226
TLR2
A	12,03	7,14	5,75	χ2 = 4,79 р = 0,029 OR = 2,24 1,07-4,68	χ2 = 0,27 р = 0,61
G	87,97	92,86	92,25
A/A	0	0	0,88	p = 1,0	p = 1,0
G/A	24,05	14,29	9,73	χ2 = 6,18 р = 0,013 OR = 2,94 1,31-6,59	χ2 = 0,83 р = 0,36
G/G	75,95	85,71	89,38	χ2 = 6,195 р = 0,013 OR = 0,38 0,17-0,83	χ2 = 0,52 р = 0,47
TLR6
Т	53,2	54,8	43,4	χ2 = 3,58 р = 0,059 OR = 1,48 0,99-2,23	χ2 = 4,22 р = 0,041 OR = 1,58 1,02-2,45
С	46,8	45,2	56,6
Т/Т	29,1	36,5	22,1	χ2 = 1,2 р = 0,27	χ2 = 4,2 р = 0,04 OR = 2,02 1,03=3,99
С/Т	48,1	36,5	42,5	χ2 = 0,59 р = 0,44	χ2 = 0,6 p = 0,44
С/С	22,8	27	35,4	χ2 = 3,5 р = 0,06 OR = 0,54 0,28-1,03	χ2 = 1,31 p = 0,25

 

Группа больных НЯК характеризовалась снижением носительства предковой формы аллеля и его гомозиготного генотипа (данные на уровне тенденции), что описывается доминантной моделью (С/С против С/Т + Т/Т, р = 0,058). В группе больных СРК были повышены частоты мутантного аллеля и его гомозиготного генотипа TLR6. Данное изменение, согласно рецессивной модели наследования повышает вероятность возникновения СРК (T/T против С/Т + C/C, р = 0,042; OR = 2,02 1,03-3,99).

Поскольку гены TLR2 и TLR6 располагаются на одной хромосоме, на последнем этапе исследования мы решили оценить параметры неравновесного сцепления и частоты гаплотипов, образованных SNPs в данных генах.

Анализ гаплотипических сочетаний TLR2 – TLR6 показал, что в группе сравнения и у больных неспецифическим язвенным колитом предковые аллели 2258*G TLR2 и 745*C TLR6 не сцеплены друг с другом. Аллель 2258*G TLR2 сцеплен с аллелем 745*Т TLR6 (группа сравнения: D’ = 0,65; χ² = 4,39; p = 0,036; НЯК: D’ = 0,5; χ² = 6,25; p = 0,012), а редкий аллель 2258*А TLR2 – с частым аллелем 745*C TLR6 (группа сравнения: D’ = 0,65; χ² = 4,39; p = 0,036; НЯК: D’ = 0,5; χ² = 6,25; p = 0,012).

В группе больных СРК установлены другие закономерности сцепления: предковые аллели сцеплены друг с другом, а мутантные – друг с другом (D’ = 0,75; χ² = 4,56; p = 0,03).

Частоты встречаемости двухлокусных гаплотипов представлены в таблице 2.

 

ТАБЛИЦА 2. ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ДВУХЛОКУСНЫХ ГАПЛОТИПОВ TLR2 – TLR6 В ГРУППАХ БОЛЬНЫХ СРК, НЯК И ПРАКТИЧЕСКИ ЗДОРОВЫХ ЛИЦ РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ

TABLE 2. FREQUENCIES OF TWO-LOCUS TLR2 – TLR6 HAPLOTYPES IN GROUPS OF PATIENTS WITH IBS, UC AND HEALTHY INDIVIDUALS OF THE RUSSIAN POPULATION

Гаплотипы TLR2 – TLR6 Haplotypes TLR2 – TLR6	Группа больных НЯК Group of patients with UC n = 79 (1)	Группа больных СРК Group of patients with IBS n = 63 (2)	Группа контроля Control n = 113 (3)	Сравнение (1) – (3) χ2, p, OR, 95% ДИ Comparison (1) – (3) χ2, p, OR, 95% CI	Сравнение (2) – (3) χ2, p, OR, 95% ДИ Comparison (2) – (3) χ2, p, OR, 95% CI
	Частота гаплотипа ± ошибка среднего Haplotype frequency ± standard error
2258*G -745*C	0,38±0,04	0,44±0,04	0,52±0,03	χ2 = 6,04 р = 0,014	χ2 = 1,74 р = 0,187
2258*G -745*Т	0,50±0,04	0,480±0,045	0,42±0,03	χ2 = 2,12 р = 0,145	χ2 = 1,15 р = 0,284
2258*А -745*C	0,089±0,020	0,008±0,008	0,05±0,01	χ2 = 2,44 р = 0,118	χ2 = 0,35 р = 0,554
2258*А -745*Т	0,032±0,010	0,06±0,02	0,009±0,006	p > 0,05	p > 0,05

 

В группе больных НЯК снижена частота сочетания аллелей 2258*G -745*C, так как данные аллели в группе больных НЯК не сцеплены, то, вероятнее всего, данное изменение связано со снижением частот обоих предковых аллелей независимо друг от друга. Все остальные частоты гаплотипов не различались во всех исследуемых группах.

Заключение

Полученные нами данные об ассоциации Arg753Gln TLR2 с предрасположенностью к неспецифическому язвенному колиту подтверждаются работой Dorofeyev A.E. и соавт., где установлена ассоциация с возрастом дебюта НЯК [6]. Согласно исследованию Yang Cheng и соавт. данный полиморфизм гена TLR2 не ассоциирован с предрасположенностью к НЯК у азиатов [5]. В нашей работе у больных НЯК показано изменение частот аллелей и генотипов Pro249Ser TLR6 на уровне тенденции, что не позволяет рассматривать данный полиморфизм как значимый фактор риска. Однако в метаанализе, проведенном Wang H. и соавт., удалось подтвердить значимость Pro249Ser TLR6 в обобщенной группе больных воспалительными заболеваниями кишечника [11].

Вероятно, различия в ассоциации предрасположенности к НЯК от носительства определенных генотипов и аллельных вариантов Arg753Gln TLR2 и Pro249Ser TLR6 могут зависеть от этнической принадлежности больных.

В доступной литературе отсутствуют данные об ассоциации SNPs TLR2 и TLR6 с предрасположенностью к СРК.

Таким образом, полученные результаты показывают, что гены основных членов семейства TLR2 по-разному ассоциированы с неспецифическим язвенным колитом и синдромом раздраженного кишечника. В качестве поиска потенциальных биомаркеров предрасположенности к НЯК и СРК целесообразно не только использовать носительство аллелей и генотипов отдельных генов TLR2 и TLR6, но и рассмотреть их межгенные взаимодействия с другими Toll-подобными рецепторами.

About the authors

D. S. Stashkevich

Chelyabinsk State University

Author for correspondence.
Email: stashkevich_dary@mail.ru

PhD (Biology), Associate Professor, Dean, Biological faculty

Russian Federation, Chelyabinsk

S. V. Belyaeva

Chelyabinsk State University

Email: stashkevich_dary@mail.ru

PhD (Biology), Associate Professor, Department of Microbiology, Immunology and General Biology, Biological faculty

Russian Federation, Chelyabinsk

A. V. Evdokimov

Chelyabinsk State University

Email: stashkevich_dary@mail.ru

PhD (Biology), Associate Professor, Department of Microbiology, Immunology and General Biology, Biological faculty

Russian Federation, Chelyabinsk

References

Supplementary files