Morphological and functional characteristics of LPS-stimulated microglial cells under the action of orexin A

Full Text

Введение

Клетки микроглии выполняют защитную функцию и по существу представляют собой иммуноциты, резидентно присутствующие в центральной нервной системе [5]. При развитии аутоиммунных заболеваний клетки микроглии выполняют функцию макрофагов, которые активируются при развитии патологических процессов в мозге, приобретают амебоидную форму, повышается экспрессия рецепторов комплемента и молекул основного комплекса гистосовместимости, а также Toll-подобных рецепторов на их мембране [13].

Активированные клетки микроглии синтезируют ряд растворимых факторов, большинство из которых – цитотоксические. При их активации увеличивается экспрессия молекул основного комплекса гистосовместимости (MHC) и костимулирующих молекул, таких как B7 и CD40, что позволяет эффективно презентировать антигены Т-клеткам. Нейротрофины и противовоспалительные цитокины подавляют экспрессию этих молекул, что указывает на наличие регуляторных сигналов, модулирующих функции микроглии [15]. При развитии аутоиммунных заболеваний центральной нервной системы повышение экспрессии MHC, костимулирующих молекул и последующая презентация антигена клетками микроглии приводит к активации Т-клеток, распознающих антигены в центральной нервной системе, что может обусловить повреждение нейронов.

Клетки микроглии, как и макрофаги крови, активируются при повреждении головного мозга и развитии инфекционного процесса, мигрируют в пораженный участок. Повреждение нейронов ведет к трансформации клеток микроглии в мигрирующие макрофаги округлой формы, которые продуцируют цитокины и трофические факторы, оказывающие повреждающее или защитное действие на клетки мозга [8].

Клетки микроглии активируются даже при небольших изменениях антигенного состава микроокружения и при помощи отростков отслеживают поврежденные клетки, апоптотические тельца, нейрофибриллярные клубки, а, например, при болезни Альцгеймера – фрагменты ДНК или бляшки [3].

В процессе развития мозга микроглиальные клетки играют основную роль в регуляции количества клеток-предшественников нейронов и удаляют умершие нейроны [14]. Эти клетки принимают участие в перестройке синаптических связей, ремоделируя и вызывая деструкцию ненужных синапсов [10].

Помимо поглощения и разрушения чужеродных веществ с помощью фагоцитоза, микроглиоциты оказывают цитотоксическое действие и, выделяя оксид азота и перекись водорода, активируют процесс повреждения клеток и гибели нейронов [4], а также продукцию эксайтотоксичных веществ, таких как глутамат.

И хотя клетки микроглии являются важнейшим компонентом иммунной системы мозга, их избыточная активация может оказывать нежелательные цитотоксические эффекты и приводить к развитию нейродегенеративных заболеваний [2]. Кроме того, затянувшийся воспалительный процесс в структурах мозга с участием микроглиоцитов может заканчиваться разрушением нейронов и развитием аутоиммунных реакций [12]. В связи с этим актуальным является поиск возможных регуляторных молекул эндогенного происхождения, которые оказывают противовоспалительное действие и коррегируют избыточную активность клеток микроглии. Одной из таких регуляторных молекул является орексин А.

Орексины – сравнительно недавно открытые нейропептиды, вырабатывающиеся небольшой популяцией гипоталамических нейронов, аксоны которых проецируются в различные структуры головного и спинного мозга [11]. Локализация орексинпродуцирующих нейронов, обилие их отростков и распределение рецепторов объясняют широкий спектр физиологических реакций, которые регулируются этой системой.

Спектр вегетативных функций, в регуляции которых участвуют орексин-содержащие нейроны, действительно разнообразен. Наиболее изученными в настоящее время является участие орексинов в поддержании цикла сон/бодрствование [6]. Система орексин-содержащих нейронов участвует в механизмах реализации нейроиммунного взаимодействия, в том числе ответе ЦНС на антигенный стимул. Активация нейронов, содержащих орексин, показана после инъекции липополисахарида (ЛПС) у различных животных. Предполагается, что нейроны, синтезирующие орексины, участвуют в комплексе антиген-индуцированных реакций, опосредующих развитие продромального периода заболеваний [7].

Дисфункция этой системы констатирована при различных формах патологии, связанных с нейродегенеративными и аутоиммунными процессами. Нарушение функции орексинэргической системы показано при нарколепсии [9]. Вопрос участия орексин-содержащих нейронов в патогенезе рассеянного склероза (РС) активно изучается.

Известно, что орексин А оказывает терапевтическое действие на течение аутоиммунного энцефаломиелита, ограничивая инфильтрацию патогенными CD4⁺Т-лимфоцитами, снижая уровень хемокинов (MCP-1/CCL2 и IP-10/CXCL10) и цитокинов (IFNγ (Th1), IL-17 (Th17), TNFα, IL-10 и TGF-β) в центральной нервной системе [1].

Введение орексинов снижает повреждение головного мозга при очаговой ишемии у мышей, что связано со снижением экспрессии IL-6 и TNFá. Кроме того, подкожное введение орексина А увеличивает выживаемость мышей с индуцированным введением липополисахарида эндотоксиновым шоком, снижая уровень провоспалительных цитокинов и хемокинов.

Целью данного исследования является определение возможного участия орексинов в регуляции функций микроглиоцитов.

Орексины, активируя основные аминергические нейромедиаторные системы, являются нейромедиаторами и обладают выраженным противовоспалительным эффектом. Однако механизмы реализации этих эффектов не ясны, как и эффекты их действия на клетки иммунной системы мозга.

Изучено действие липополисахарида на фенотипические особенности клеток микроглии в динамике. Как известно, длина филоподий микроглиальных клеток изменяется при ее активации и переходе в фенотип M1 [12]. В покое клетки микроглии имеют разветвленную форму с более длинными отростками, а при активации приобретают амебовидную форму и отростки укорачиваются.

Проведен анализ эффектов действия орексина А на морфофункциональные особенности клеток микроглии в активированном состоянии и степени экспрессии рецепторов к орексину OXR1 на мембранах их клеток.

Комплекс проведенных исследований позволил установить эффекты действия орексина на морфофункиональные особенности микроглиоцитов, что представляется перспективным для разработки новых подходов к терапии инфекционных, воспалительных, нейродегенеративных и аутоиммунных процессов, происходящих в центральной нервной системе.

Материалы и методы

Экспериментальные животные

Эксперименты проводили в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных Японии и их протоколы одобрены этическим комитетом по уходу и использованию животных. В исследовании использовали мышей-самцов, чтобы избежать возможных изменений во время смены фаз цикла. Животным был предоставлен свободный доступ к пище и воде, они содержались в условиях 12-часового цикла день/ночь.

Экспериментальные животные (refer: Akiyoshi 2018 eNeuro), мыши дикого типа (c57BL6, самцы в возрасте 2 месяцев (n = 9)) перед стереотаксической инъекцией получали анестезию кетамином (74 мг/кг, внутрибрюшинно) и изофлуоран (ингаляционно).

Стереотаксические инъекции

Мышь помещали в стереотаксический прибор и надежно фиксировали голову. Затем череп обнажали и очищали. Точки лямбда и брегма на черепе находились на одинаковой высоте. Устанавливали кончик иглы на точку брегмы, фиксировали ее координаты, вычисляли координаты, необходимые для инъекции.

Животным вводили интрацеребровентрикулярно во второй желудочек раствор орексина А – 1 мкл в концентрации 0,3 mM (Sigma-Aldrich, США). Скорость автоматической системы подачи составила не более 0.5 мкл/мин. Контрольным животным вводили 1 мкл физиологического раствора NaCl. Затем иглу извлекали, разрез зашивали и дезинфицировали.

Животных перемещали в клетку, обеспечив им легкий доступ к пище и воде на время восстановления после процедуры.

Антигенное воздействие

Спустя час после введения орексина А, животным обеих групп вводили внутрибрюшинно липополисахарид (ЛПС) в дозе 2 мг/кг веса (LPS, Funakoshi chemical, Токио, Япония). Спустя семь часов после начала эксперимента проводили интракардиальную перфузию с помощью перистальтического насоса с последующим извлечением и фиксацией мозга для иммуногистохимического анализа.

Для оценки влияния ЛПС на морфофункциональную активность микроглиальных клеток мышам внутрибрюшинно вводили ЛПС в дозе 2 мг/ кг (n = 6) или физиологический раствор в том же объеме 0,1 мл (n = 3). Через 7 или 24 часа после начала эксперимента проводили перфузию, извлекали мозг для дальнейшей фиксации и иммуногистохимического анализа.

Подготовка срезов мозга

Фиксацию ткани мозга осуществляли при помощи интракардиальной перфузии, которую проводили с использованием перистальтического насоса малой мощности. В качестве промывочного буфера использовали фосфатно-солевой буфер (PBS), в качестве фиксирующего раствора – 4%-ный раствор параформальдегида (PFA). Извлекали мозг и помещали его в 4%-ный раствор параформальдегида для дальнейшей фиксации. Замороженные срезы мозга готовили с помощью вибротома (Leica Microsystem, Германия). Толщина фронтальных срезов составила 50 мкм. После нарезки срезы помещали на хранение в 1,5% раствор параформальдегида.

Иммуногистохимическое окрашивание

Для отмывки от параформальдегида инкубировали срезы при комнатной температуре в течение 20 минут в растворе Cl 100 mM в фосфатно-солевом буфере (pH = 7,4). Далее осуществляли пермеабилизацию фиксированной ткани, применяя 0,1% (вес/объем) Triton X-100 в фосфатно-солевом буфере при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем в блокирующем буфере при комнатной температуре в течение 6 часов. Отмывали срезы в PBS 3 раза по 5 минут и помещали в блокирующий буфер (5% BSA в PBS) на 6 часов при комнатной температуре. Затем повторяли отмывку в фосфатно-солевом буфере 3 раза по 5 минут и помещали срезы в в буфер (2,5% BSA в фосфатно-солевом буфере, 0,2% Tween 20), содержащий первичные моноклональные кроличьи антитела к Iba1 (в разведении 1:500, Вако, Осака, Япония), и оставляли на ночь на шейкере при +4 °С. Затем удаляли раствор с антителами и промывали в PBS, 4 раза по 30 минут для удаления несвязанных первичных антител. Инкубировали срезы с вторичными флуоресцентно-меченными антителами Alexa Flour 488, или Alexa Fluor 594 (Abcam, United Kingdom) (1/2000) и, в зависимости от целей эксперимента, в блокирующем буфере в шейкере на низкой скорости в течение ночи при комнатной температуре или при 4 °C. Удаляли раствор с антителами и промывали в PBS 4 раза по 30 минут для удаления несвязанных вторичных антител. Далее срезы монтировали на стекла при помощи специального клея для срезов MountClue Glass.

Ядра клеток окрашивали флуоресцентным красителем VEC H-1200 с DAPI. Анализ клеток микроглии в ткани головного мозга проводили на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Nicon Eclipse TI (Токио, Япония).

Анализировали коронарные срезы мозга в области соматомоторной и соматосенсорной коры на уровнях 33-35 по атласу (Allen Brain Atlas). Обработку полученных фотографий проводили с помощью программы ImageJ с использованием плагина Simple Neurite Tracer и Multi-point.

Результаты и обсуждение

Реакции клеток микроглии на внутрижелудочковое введение орексина А у мышей

Проанализированы размеры микроглиоцитов, локализованных в соматосенсорной и моторной зонах коры и полосатого тела, а также их отростков после введения орексина А. Проведенный анализ не позволил выявить изменений отростков микроглиальных клеток (рис. 1).

 

Рисунок 1. Длина отростков микроглиальных клеток, локализованных в соматосенсорной (А), моторной зонах коры (Б) и полосатого тела (В)

Figure 1. The length of processes of microglial cells localized in the somatosensory (A), motor cortex (B), and striatum (C)

 

Реакции клеток микроглии мышей на внутрибрюшинное введение липополисахарида

Подсчет количества микроглиоцитов на срезах соматосенсорной коры позволил установить возрастание степени активации этих клеток при введении ЛПС: происходит увеличение количества микроглиальных клеток в соматосенсорной коре на 12% через 7 часов и на 25% через 24 часа (рис. 2).

 

Рисунок 2. Количество клеток микроглии в зоне S1 коры головного мозга после введения ЛПС (через 7 и 24 часа)

Figure 2. Number of microglial cells in the somatosensory zone of the cerebral cortex after LPS administration (after 7 and 24 hours)

 

Заключение

Клетки микроглии выполняют защитную функцию и являются иммуноцитами, присутствующими в центральной нервной системе. Их активация приводит к выработке цитокинов, которые могут оказывать повреждающее или защитное действие на клетки мозга. Как известно, Орексин А обладает противовоспалительным и нейропротективным действием. Подкожное введение орексина А повышает выживаемость мышей с индуцированным липополисахаридом эндотоксиновым шоком на 80%, снижая уровень провоспалительных цитокинов и хемокинов.

Таким образом, исследование эффектов действия орексина А, вводимого во второй желудочек мозга, на морфофункциональные характеристики клеток микроглии, активированных внутрибрюшинной инъекцией липополисахарида (ЛПС), позволило констатировать изменение количества и морфофункциональных особенностей клеток микроглии в соматосенсорной коре, а именно активности микроглиоцитов, на мембранах которых представлены рецепторы к орексинам OXR1. И хотя введение орексина-А животным после предварительной инъекции ЛПС не вызвало значительных изменений процессов, инициированных действием ЛПС, происходит увеличение длины их отростков в моторной зоне коры головного мозга.

Более того, продемонстрировано изменение количества рецепторов к орексинам OXR1 на клетках микроглии при введении липополисахарида.

Установленные в настоящей работе эффекты нейромедиатора орексина А на морфофункциональные характеристики клеток микроглии могут служить основой для создания препаратов, позволяющих адресно коррегировать функции иммунной системы мозга.

Это исследование было поддержано Японо-российский центр молодежных обменов (JREX, Токио, Япония) и выполнялось в лаборатории Гомеостатических разработок Национального Института физиологических наук, Окадзаки, Япония, под руководством профессора Ю. Набекура.

About the authors

A. P. Synchikova

Research Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: 9410206@gmail.com

Postgraduate Student, Department of General Pathology and Pathogolical Physiology

Russian Federation, St. Petersburg

E. A. Korneva

Research Institute of Experimental Medicine

Email: 9410206@gmail.com

Professor, Full Member, Russian Academy of Sciences, Chief Research Associate, Department of General Pathology and Pathogolical Physiology

Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files