Effect of mifepristone under acute stress on thymocyte apoptosis in mice

Full Text

Введение

В 1936 г. канадским патологом Гансом Селье в экспериментах с адреналэктомией было доказано участие гормонов коры надпочечников в развитии акцидентальной инволюции тимуса при стрессе [6]. К 1970-м гг. среди исследователей доминировало представление о лизисе лимфоидных клеток глюкокортикоидами как основном механизме этих изменений [3]. Позже рассматривалась и роль усиления миграции из тимуса Т-лимфоцитов, а также снижения миграции в него костномозговых предшественников, а с 1990-х гг. – индуцированного глюкокортикоидами апоптоза, что детально изложено в ряде статей [1, 4]. Для выяснения вклада глюкокортикоидов в те или иные процессы в условиях целостного организма удобным инструментом в экспериментальной эндокринологии и фармакологии является введение самцам крыс или мышей антагониста глюкокортикоидных и прогестероновых рецепторов мифепристона, известного так же как RU-38486 или RU-486 [2].

Цель работы – исследование влияния мифепристона при остром стрессе на апоптоз тимоцитов мышей.

Материалы и методы

Экспериментальные исследования выполнены на самцах белых неинбредных мышей в возрасте 24-30 недель. Всех животных содержали в условиях вивария на стандартной диете (со свободным доступом к пище и воде) и стандартном освещении (12 ч света и 12 ч темноты). Все исследования одобрены на соответствие нормам биомедицинской этики этическим комитетом при «ИЭГМ УрО РАН», протокол № 3 от 30.11.2015 г.

Антагонист глюкокортикоидных и прогестероновых рецепторов мифепристон (Mifepristone, Sigma-Aldrich, M8046, син.: 11β -(4-Dimethyl-amino)-phenyl-17β -hydroxy-17-(1-propynyl)-estra-4,9-dien-3-one, RU-38486, RU-486) вводили однократно подкожно за 30 мин до начала иммобилизации в дозе 50 мг/кг массы тела в растворе, приготовленном на стерильном официнальном оливковом масле. Контрольным мышам и животным группы сравнения вводили однократно подкожно эквивалентное количество растворителя препарата. Выбор дозы и способа введения мифепристона основывался на ранее проведенных исследованиях [2]. Для экспериментального моделирования острого стресса использовали классическую модель 24-часового иммобилизационного стресса в положении на спине в пластиковом рестрейнере (комбинация эмоционального стресса и чрезмерного физического напряжения) [5, 6].

Для оценки апоптоза тимоцитов методом проточной лазерной цитометрии использовали набор реактивов BD PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen™). Суспензию клеток тимуса мышей получали общепринятым методом гомогенизации в пробирках Эппендорф в 1,0 мл полной питательной среды с помощью стерильного полипропиленового пестика (Tissue Grinder, Axygen^®). После подсчета исходного числа ядросодержащих клеток (ЯСК) их отмывали центрифугированием и доводили их концентрацию до 1 × 10⁶ ЯСК на 1,0 мл однократного связывающего буфера BD. В связи с тем, что набор реактивов BD содержал те же реагенты, что и набор Guava Nexin^® Reagent производителя использованного нами проточного лазерного цитометра Guava EasyCyte корпорации Millipore, мы модифицировали инструкцию к набору и дальнейший анализ проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя проточного цитометра, что позволило сэкономить реактивы. В опытных пробах смешивали 20 мкл клеток (концентрация 2 × 10⁴/лунку или 1 × 10⁶/1,0 мл), приготовленных на однократном связывающем буфере BD c 2 мкл смеси рабочих концентраций аннексина V-PE (PE Annexin V) и 7-аминоактиномицина D (7-AAD), инкубировали 20 мин в темноте при комнатной температуре, добавляли 180 мкл однократного связывающего буфера BD в каждую лунку, перемешивали и сразу же анализировали результаты на цитометре. Использовали следующие контроли: 1) неокрашенные клетки на реагентах BD (вместо аннексина V-PE и 7-ADD добавляли такой же объем однократного связывающего буфера BD; контроль аутофлуоресценции, использующийся в качестве негативной пробы для настройки цитометра); 2) клетки, окрашенные только аннексином V-PE (вместо 7-ADD вносили однократный связывающий буфер BD); 3) клетки, окрашенные только 7-ADD (вместо аннексина V-PE вносили однократный связывающий буфер BD). В качестве позитивного контроля в нескольких отдельных экспериментах анализировали показатели тех же клеточных суспензий после естественной гибели клеток при их инкубации в течение 2-3 сут. в полной питательной среде при 40 °С. Анализ проводили в модуле Guava Nexin Assay программного обеспечения Millipore CytoSoft 5.3 для проточного цитометра Guava EasyCyte (Millipore) по инструкции производителя, получая следующие показатели для каждой клеточной суспензии: 1) процент аннексин V-негативных и 7-AAD-позитивных клеток (Annexin V-negative, 7-AAD-positive; upper left; ядерный дебрис); 2) процент аннексин V-позитивных и 7-AAD-позитивных клеток (Annexin V-positive, 7-AAD-positive; upper right; клетки, находящиеся в состоянии позднего апоптоза и некроза); 3) процент аннексин V-негативных и 7-AAD-негативных клеток (Annexin V-negative, 7-AAD-negative; lower left; живые клетки без признаков апоптоза и некроза); 4) процент аннексин V-позитивных и 7-AAD-негативных клеток (Annexin V-positive, 7-AAD-negative; lower right; клетки, находящиеся в состоянии раннего апоптоза); 5) общий процент аннексин V-позитивных клеток (Annexin V-positive); 6) общий процент 7-AAD-позитивных клеток (7-AAD-positive), а также показатели средней интенсивности флуоресценции (the mean fluorescence intensity, MFI) для каждого из вышеперечисленных параметров в каналах PM1 (Annexin V PE) и PM2 (7-AAD).

Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики и апостериорного критерия Дункана (post-hoc Duncan’s test) для множественного сравнения между группами. Результаты представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±m).

Результаты и обсуждение

Установлено, что острый стресс, вызванный 24-часовой иммобилизацией мышей, приводит к увеличению в тимусе общего относительного числа 7-AAD-позитивных клеток, а также доли клеток, окрашивающиеся 7-AAD, но не аннексином V-PE (ядерный дебрис, аннексин V(-), 7-AAD (+)) (табл. 1). Процент клеток, находящихся в состоянии раннего апоптоза (т. е. аннексин V-PE-позитивных и 7-AAD-негативных), так же как и общее относительное число клеток, несущих фосфатидилсерин (аннексин V-PE-позитивные клетки), в тимусе стрессированных мышей не отличаются от контроля. Введение мифепристона нивелирует вызванное острым стрессом изменения и соответствующие показатели статистически значимо не отличаются от контроля (см. табл. 1), что подтверждает участие глюкокортикоидов в увеличении числа тимоцитов в состоянии некроза.

 

ТАБЛИЦА 1. ВЛИЯНИЕ МИФЕПРИСТОНА ПРИ ОСТРОМ СТРЕССЕ НА АПОПТОЗ ТИМОЦИТОВ МЫШЕЙ

TABLE 1. EFFECT OF MIFEPRISTONE UNDER ACUTE STRESS ON APOPTOSIS OF MURINE THYMOCYTES

Показатели Parameters	Номер группы и экспериментальное воздействие Number of group and experimental exposure
	1. Контрольные мыши 1. Control mice (n = 11)	2. Острый стресс 2. Acute stress (n = 14)	3. Острый стресс и мифепристон 3. Acute stress and mifepristone (n = 14)
Ядерный дебрис, Аннексин V(-), 7-AAD (+), % Nuclear debris, Annexin V(-), 7-AAD (+), %	1,327±0,352	4,250±1,119*	2,957±0,746
Клетки в позднем апоптозе, Аннексин V(+), 7-AAD(+), % Late apoptotic cells, Annexin V(+), 7-AAD(+), %	13,864±2,369	19,671±2,605	17,529±2,566
Неповрежденные клетки, Аннексин V(-), 7-AAD(-), % Live, healthy cells, Annexin V(-), 7-AAD(-), %	76,509±2,827	69,543±3,311	71,079±4,016
Клетки в раннем апоптозе, Аннексин V(+), 7-AAD(-), % Early apoptotic cells, Annexin V(+), 7-AAD(-), %	8,300±0,942	6,564±0,821	8,486±1,684
Аннексин V(+) клетки, % Annexin V(+) cells, %	22,191±2,617	26,229±3,211	26,000±3,988
7-AAD(+) cells, %	15,200±2,641	23,936±2,798*	20,443±2,683

Примечание. * – p < 0,05 по отношению к контрольной группе по критерию Дункана для множественного сравнения между группами; различия между второй и третьей группами статистически не значимы.

Note. *, p < 0.05 in relation to the control group according to post-hoc Duncan’s test for multiple comparison between groups; differences between the second and third groups are not statistically significant.

 

Обсуждая полученные результаты, важно отметить, что в условиях 24-часовой иммобилизации нами не выявлено повышения числа клеток, находящихся в состоянии раннего апоптоза. Напротив, через 24 ч от начала стрессорного воздействия отмечается статистически значимое повышение числа тимоцитов с поврежденными мембранами, через которые легко проникает 7-ADD. Введение антагониста глюкокортикоидных и прогестероновых рецепторов самцам мышей за 30 мин от начала иммобилизации частично отменяет выявленные изменения, что подтверждает участие глюкокортикоидов при стрессе в увеличении числа тимоцитов в состоянии некроза. Возможно, что увеличение числа тимоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, при иммобилизационном стрессе развивается в более ранние сроки, что требует дополнительных исследований. Подтверждением этому является недавно опубликованная работа [7], в которой для выявления раннего апоптоза тимоцитов через 3 ч после введения гидрокортизона использовали метиловый эфир тетраметилродамина.

Заключение

Таким образом, острый стресс, вызванный 24-часовой иммобилизацией мышей, приводит к увеличению в тимусе общего относительного числа 7-AAD-позитивных клеток, а также доли клеток, окрашивающиеся 7-AAD, но не аннексином V-PE (ядерный дебрис, аннексин V(-), 7-AAD (+)). Введение мифепристона нивелирует эти изменения, что подтверждает участие глюкокортикоидов в увеличении числа тимоцитов в состоянии некроза.

Исследования проводились в рамках государственного задания «ИЭГМ УрО РАН» по теме: «Механизмы регуляции иммунной системы» – регистрационный номер НИОКТР АААА-А19-119112290007-7.                

About the authors

Yu. I. Shilov

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; E.A. Wagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: jshilov@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Senior Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology; Associate Professor, Department of Immunology

Russian Federation, Perm; Perm

S. Yu. Shilov

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; E.A. Wagner Perm State Medical University

Email: jshilov@mail.ru

PhD (Medicine), Junior Research Asociate, Laboratory of Ecological Immunology; Associate Professor, Department of Normal Physiology

Russian Federation, Perm; Perm

S. Yu. Barkov

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: jshilov@mail.ru

Postgraduate Student, Laboratory of Ecological Immunology

Russian Federation, Perm

N. A. Shilova

E.A. Wagner Perm State Medical University

Email: jshilov@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Immunology

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files