Content of PD-1+ and PD-L1+ peripheral blood lymphocytes in individuals with pollen sensitization before and after allergen-specific immunotherapy

Full Text

Введение

Аллергический ринит (АР) и атопическая бронхиальная астма (БА) являются широко распространенными хроническими заболеваниями, которые опосредованны IgE-зависимым воспалением респираторного тракта, возникающим в результате действия аллергенов [1, 3]. Единственным этиотропным методом лечения АР и атопической БА, который способен повлиять на течение заболевания и достичь стойкой ремиссии, является аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ). Цель АСИТ – достижение иммунологической толерантности к причинно-значимому аллергену путем введения его экстракта в организм пациента в постепенно возрастающих дозах [4]. Тем не менее у части пациентов клинический эффект от лечения отсутствует, что может быть связано с особенностями регуляции иммунного ответа. Важными иммунорегуляторными молекулами являются рецептор программируемой клеточной смерти (PD-1) и его лиганды (PD- L1 и PD-L2), основной функцией которых является коингибирование и костимуляция иммунного ответа при инфекционных, аутоиммунных, аллергических, а также онкологических заболеваниях [6]. Известно, что передача сигнала через молекулу PD-1 на поверхности Т-лимфоцитов приводит к ингибированию их пролиферации и передачи сигнала через Т-клеточный рецептор. Этот механизм играет роль в поддержании иммунологической толерантности [9]. Роль PD-1 пути при аллергических заболеваниях описана в научной литературе на моделях БА и АР [10]. Имеющиеся данные о вкладе оси PD-1/PD-L в иммунорегуляторные процессы позволяют предположить участие этих механизмов в развитии толерантности при проведении иммунотерапии. Поэтому задача исследования экспрессии PD-1 и его лиганда PD-L1 на различных субпопуляциях лимфоцитов периферической крови (ПК) пациентов, страдающих АР и БА в динамике проведения АСИТ представляется актуальной.

Материалы и методы

Материалом исследования служила периферическая венозная кровь, получаемая от пациентов с аллергопатологией и условно здоровых доноров. Критерием включения считалось наличие диагноза АР средней и тяжелой степени, а также наличие контролируемой атопической БА легкой или средней степени тяжести. Диагнозы АР и БА выставлялись в соответствии с клиническими рекомендациями РААКИ «Аллергический ринит» от 2018 г. и GINA-2019, соответственно. Забор крови производился с предварительного информированного согласия испытуемых, у доноров – однократно, у пациентов, в целях оценки изменений в динамике, трижды: вне обострения до начала АСИТ; вне обострения после завершения АСИТ; в период предполагаемого обострения после завершения АСИТ, т. е. во время поллинации причинно-значимых растений. Наличие сенсибилизации к причинно-значимым аллергенам во всех случаях подтверждалось результатами кожного скарификационного тестирования. Лечение проводилось по стандартной схеме предсезонной подкожной АСИТ (пкАСИТ) вне сезона цветения растений, являющихся причинно-значимыми аллергенами.

Мононуклеарную фракцию (МНК) выделяли из ПК в градиенте плотности фиколл-урографин в соответствии со стандартной методикой. Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов и оценка уровня экспрессии молекул PD-1 и PD-L1 на них осуществлялись методом проточной цитофлуориметрии. Для каждого человека, участвующего в исследовании, использовали 1 × 10⁶ МНК ПК, окрашивание проводили моноклональными антителами, меченными флуорохромом, в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем (Biolegend, San Diego, CA, США). Анализ фенотипа лимфоцитов проводился на проточном цитофлуориметре FACS Canto II (BD, США) с использованием программного обеспечения FACS Diva (BD, США). Клетки с фенотипом CD19⁺CD4^- расценивались как В-лимфоциты; цитотоксические Т-лимфоциты распознавались по фенотипу CD3⁺CD4^-; Т-хелперы определялись как CD3⁺CD4⁺ клетки; фенотип CD3⁺CD4⁺CD127^lowCD25^high соответствовал регуляторным Т-лимфоцитам (Treg). Для оценки экспрессии PD-1 и PD-L1 применялся также FMO-контроль (fluorescence minus one) для каждой пробы, который включал всю соответствующую панель, за исключением антител к указанным антигенам. Статистический анализ данных проводился с использованием пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft). Для оценки значимости различий между группами пациентов и условно здоровых доноров использовался критерий Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

Исследуемая группа составила 12 пациентов с АР и БА (6 женщин и 6 мужчин), в возрасте от 22 до 46 лет, из них 7 пациентов с АР (средний возраст 31,6±2,8 года) и 5 пациентов с БА (средний возраст 33,8±2,7 года). В качестве группы сравнения были обследованы условно здоровые доноры в количестве 12 человек (6 женщин и 6 мужчин), в возрасте от 23 до 44 лет (средний возраст 32,8±1,8 года). В среднем стаж заболевания в группе пациентов с аллергопатологией составил 13,6 лет (4-29 лет). Все пациенты с БА имели в качестве сопутствующего диагноза АР. Более 50% всех пациентов имели сопутствующий аллергический конъюнктивит, у 33% пациентов проявления аллергического ринита сопровождались перекрестной пищевой непереносимостью, у 17% наблюдалась лекарственная аллергия.

Все пациенты с БА имели поливалентную сенсибилизацию. Большинство пациентов с АР – 6 человек (85,7%) также были сенсибилизированы к 2 и более аэроаллергенам, тогда как моновалентная сенсибилизация к пыльце деревьев наблюдалась лишь у 1 пациента с АР. Наиболее часто среди пациентов с обоими диагнозами встречалась клинически значимая сенсибилизация к пыльце деревьев и злаковых трав (83% всех пациентов), наиболее редко – эпидермальная сенсибилизация (25% всех пациентов). Учитывая тяжесть клинической симптоматики при контакте с аллергеном, всем пациентам была показана пкАСИТ пыльцевыми аллергенами. Большая всех часть пациентов – 8 человек (67%) получали смесь пыльцы деревьев во время проведения курса пкАСИТ. Из них всего 4 человека (33% всех пациентов) получали пыльцу деревьев в комбинации с аллергенами злаков или сорных трав. В то время как оставшиеся 2 человека (17% всех пациентов) получали моновалентную терапию пыльцой сорных трав, 1 человек – терапию пыльцой злаков и 1 человек – АСИТ комбинацией злаков и сорных трав.

Было показано, что количество В-лимфоцитов до начала терапии не отличалось от показателей группы доноров при АР (рис. 1А), но было повышено у пациентов с БА (рис. 1Б). После завершения курса АСИТ содержание В-лимфоцитов достоверно снижалось у пациентов с АР по сравнению с донорской группой и приходило в норму у пациентов с БА. Примечательно, что данные изменения сохранялись и в период предполагаемого обострения аллергопатологии в связи с цветением причинно-значимых растений в сравнении с условно здоровыми донорами (рис. 1 А, Б).

Экспрессия молекулы PD-1 B-лимфоцитами ПК не отличалась до начала лечения и на протяжении курса АСИТ у пациентов с АР и БА от показателей группы условно здоровых доноров (данные не представлены). Также было показано, что количество В-лимфоцитов, экспрессирующих молекулу PD-L1, не отличалось у пациентов с АР и БА до начала лечения и у доноров, однако, достоверно повышалось у больных АР после АСИТ, при этом в сезон поллинации данные изменения не сохранялись – не было значимой разницы между пациентами и группой контроля (рис. 1В).

 

Рисунок 1. Относительное содержание В-лимфоцитов и PD-L1-позитивных В-лимфоцитов в периферической крови у пациентов с БА и АР в сравнении с условно здоровыми донорами до и после проведения АСИТ

Примечание. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25 и 75 процентили); * – указаны достоверные различия с группой доноров (U-критерий Манна–Уитни).

Figure 1. Relative content of B lymphocytes and PD-L1-positive B lymphocytes in peripheral blood of patients with BA and AR before and after ASIT in comparison with healthy donors

Note. Data in the diagram are given as median and interquartile range (25 and 75 percentiles). *, significant differences between patients and healthy donors (Mann–Whitney U test).

 

Относительное содержание CD8⁺Т-лимфоцитов ПК не изменялось у пациентов с АР и БА в сравнении с донорскими показателями во всех трех точках исследования. Также обнаружено, что процент PD-1⁺ цитотоксических Т-лимфоцитов был ниже у пациентов с АР до начала терапии по сравнению с группой контроля, после проведения АСИТ относительное содержание данной популяции клеток приходило в норму. Примечательно, что эти изменения сохранялись в сезон поллинации (рис. 2А). У пациентов с БА статистически значимой разницы в содержании этой субпопуляции клеток в сравнении с условно здоровыми донорами выявлено не было (данные не представлены).

Было показано, что между группой доноров и группами пациентов с АР и БА до начала курса терапии причинно-значимыми аллергенами и после его окончания нет отличий в содержании Т-хелперов ПК. Были выявлены значимые изменения в относительном содержании PD- 1⁺ хелперных Т-лимфоцитов у пациентов с АР: оно было достоверно ниже у пациентов до и после проведения АСИТ относительно группы доноров. Интересно, что в сезон предполагаемого обострения содержание данной популяции клеток приходило в норму, о чем свидетельствовало отсутствие значимых различий по сравнению с группой контроля (рис. 2Б). У пациентов с БА достоверной разницы по данному показателю ни в одной точке выявлено не было (данные не представлены).

 

Рисунок 2. Относительное содержание PD-1-позитивных CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитов периферической крови у пациентов с АР в сравнении с условно здоровыми донорами до и после проведения АСИТ

Примечание. См. примечание к рисунку 1.

Figure 2. Relative content of PD-1-positive CD4⁺ and CD8⁺T lymphocytes in peripheral blood of patients with AR before and after ASIT compared with healthy donors

Note. As for Figure 1.

 

Относительное содержание регуляторных Т-лимфоцитов не изменялось в группах пациентов в сравнении с группой доноров. Процент PD-1⁺ регуляторных Т-лимфоцитов оказался достоверно ниже у пациентов с АР и БА до проведения терапии, чем у контрольной группы, однако у больных АР это снижение сохранялось на протяжении всего эксперимента (рис. 3А). Тогда как у пациентов, страдающих БА, после лечения и в сезон паллинации содержание PD-1⁺ регуляторных Т-лимфоцитов восстанавливалось до донорских значений (рис. 3Б).

 

Рисунок 3. Относительное содержание PD-1-позитивных регуляторных Т-лимфоцитов периферической крови у пациентов с АР и БА в сравнении с условно здоровыми донорами до и после проведения АСИТ

Примечание. См. примечание к рисунку 1. Содержание клеток указано в % от общего числа CD4⁺ лимфоцитов.

Figure 3. Relative content of PD-1-positive regulatory T lymphocytes in peripheral blood of patients with AR and BA before and after ASIT in comparison with healthy donors

Note. As for Figure 1. The content of cells is given as % of the total number of CD4⁺ lymphocytes.

 

По полученным данным больные БА имеют более высокое относительное содержание В-лимфоцитов ПК по сравнению со здоровыми людьми. Эти результаты соотносятся с данными других исследований [2, 5] и могут быть связаны с высокой активностью гуморального звена иммунитета у лиц, страдающих БА. Проведение АСИТ приводило к значимому снижению содержания В-лимфоцитов в крови у пациентов с АР и БА относительно исходного уровня, что указывает на уменьшение активности В-клеточного иммунного ответа под воздействием терапии и согласуется с литературными данными [2]. Можно предположить, что повышение содержания PD-L1-позитивных B-лимфоцитов у пациентов с AР после проведения АСИТ связано с активацией регуляторных B-клеток (Bregs) после терапии, поскольку ранее было показано, что АСИТ индуцирует образование Bregs [7]. Кроме того, PD-L1 является одной из регуляторных молекул Bregs, участвующей в ингибировании CD4⁺Т-клеток [12].

При изучении экспрессии PD-1 удалось установить достоверное снижение относительного содержания в крови всех основных субпопуляций Т-лимфоцитов (хелперов, киллеров и регуляторных клеток), экспрессирующих данную молекулу, у больных АР до АСИТ относительно условно здоровых доноров. А также у пациентов с БА было установлено достоверное снижение относительного содержания PD-1⁺ регуляторных Т-клеток по сравнению с условно здоровыми донорами до проведения АСИТ, которое восстанавливалось после проведения АСИТ до донорских значений. Ранее было показано, что при БА низкая экспрессия PD-1 циркулирующими CD4⁺Т-клетками ассоциирована с высокими концентрациями специфических IgE после провокации аллергеном при аллергической астме [8]. Таким образом, можно полагать, что низкий уровень PD-1 на T-хелперах и регуляторных Т-клетках указывает на наличие у них функциональных нарушений при аллергопатологии. Поскольку дефекты Tregs у пациентов с аллергией могут быть восстановлены с помощью специфической иммунотерапии [13], то восстановление количества PD-1⁺ регуляторных Т-лимфоцитов при БА и PD-1⁺T-хелперов и Т-киллеров при АР свидетельствует об их реконституции в результате АСИТ. Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что снижение экспрессии PD-1 имеет патогенетическое значение для аллергопатологии, а повышение экспрессии играет протективную роль. Примечательно, что в исследовании Xi X. и соавт. полученные данные были противоположными: отмечалось аномальное увеличение количества PD-1⁺Tregs при БА [14]. Такое противоречие может объясняться тем, что исследование Xi X. проводилось на детской популяции.

Заключение

Проведенное исследование подтверждает гипотезу о том, что аллергические заболевания могут быть связаны с нарушением процессов активации и супрессии клеток иммунной системы, а также свидетельствуют об изменении данных процессов в результате проведения АСИТ. Наблюдаемые между АР и БА различия в экспрессии PD-1 и PD-L1 в ответ на АСИТ можно рассматривать как различные паттерны иммунного ответа при этих заболеваниях. Учитывая, что в настоящее время отсутствуют достоверные прогностические маркеры эффективности АСИТ у пациентов с аллергопатологией, несмотря на наличие различных методов оценки этого показателя [11], ось PD-1/PD-L1 потенциально может стать перспективным маркером для диагностики и оценки эффективности АСИТ. Однако необходимы дальнейшие исследования, которые помогут установить роль взаимодействий PD-1 и PD-L1 в процессе модификации аллергических реакций, вызванной АСИТ.

Данная работа выполнена в рамках ПНИ (номер гос. регистрации в ЕГИСУ НИОКТР 122012000386-7).

About the authors

M. Sh. Barkovskaya

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Author for correspondence.
Email: margaritabarkovskaya@gmail.com

PhD (Medicine), Research Associate, Laboratory of Clinical Immunopathology

 

Russian Federation, Novosibirsk

P. V. Sevastyanov

Novosibirsk National Research State University

Email: margaritabarkovskaya@gmail.com

Student

Russian Federation, Novosibirsk

D. V. Demina

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: margaritabarkovskaya@gmail.com

PhD (Medicine), Allergologist-Immunologist, Head, Department of Allegology

Russian Federation, Novosibirsk

V. A. Kozlov

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: margaritabarkovskaya@gmail.com

PhD, MD (Medicine), Professor, Full Member, Russian Academy of Sciences, Head, Laboratory of Clinical Immunopathology, Scientific Director

Russian Federation, Novosibirsk

References

Supplementary files