PD-1 expression on T cell subsets from peripheral blood of patients with allergic diseases

Full Text

Введение

Иммунный ответ начинается с активации Т-клеток, которая инициируется антиген-зависимым сигналом через Т-клеточный рецептор и контролируется антиген-независимыми сигналами через стимуляторные (CD80/86-CD28) и ингибиторные (PD-1, Tim-3) корецепторы. PD-1 один из ингибиторных корецепторов играет важную роль в регуляции аутоиммунитета, противоинфекционного и противоопухолевого иммунитета. Продолжительная антигенная стимуляция приводит к истощению T-клеток, что наблюдается при хронических вирусных и бактериальных инфекциях и сопровождается высокой экспрессией PD-1 и Tim-3 на CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитах [1]. Известно, что взаимодействие рецептора PD-1 с его лигандами приводит к подавлению активации, пролиферации Т-клеток и продукции ими цитокинов [2]. В частности, было показано, что сигналинг от PD-1 рецептора приводит к ограничению иммунного ответа CD4⁺T-клетками в ответ на стимуляцию аллергенами [3]. Tim-3 также является ингибиторным рецептором, при связывании его с лигандом galectin-9 снижается клеточная пролиферация и происходит индукция апоптоза Th1-клеток. Следовательно, Tim-3/galectin-9 сигнальный путь, подавляя Th1-ответ, может косвенно влиять на усиление реализации Th2-ответа и способствовать развитию аллергических заболеваний [4]. В экспериментах in vivo введение антител к Tim-3 приводило к увеличению продукции Th1-цитокинов и угнетению продукции Th2-цитокинов в ткани легкого [4]. Было показано значительное увеличение процента и абсолютного числа двойных-позитивных по Tim-3 и PD-1 CD4⁺T-клеток у пациентов с астмой по сравнению со здоровыми донорами, также у пациентов был повышен процент и абсолютное число CD4⁺Tim-3⁺ клеток и CD4⁺PD-1⁺ клеток [5]. Однако в литературе представлены данные, свидетельствующие о том, что Tim-3 не является ключевым звеном для развития острого или хронического аллергического воспаления дыхательных путей в модели с индукцией аллергического воспаления дыхательных путей аллергеном клеща домашней пыли у нокаутных по гену Tim-3 мышей [4]. Хотя авторы предполагают, что, возможно, Tim-3 способствует снижению числа инфильтрирующих легкие лимфоцитов при хроническом индуцированном воспалении дыхательных путей.

В основе аллергической реакции при бронхаильной астме и аллергическом рините зачастую лежит активация Th2-звена иммунитета. Продуцируемые Th2-клетками цитокины способствуют эозинофилии, гиперплазии бокаловидных клеток, продукции IgE, ремоделированию и гиперреактивности дыхательных путей [6]. Т-клетки, отвечающие на аллергены, являются гетерогенными. Среди популяции классических Th2-клеток были выделены неклассические: Th2/Th17-клетки, способные продуцировать IL-4 и IL-17 [7], а также «Th2A»-клетки, коэкспрессирующие CRTH2, CD49d, CD161, и по данным транскриптомного анализа инициирующие патогенетический ответ при аллергическических заболеваниях [8].

Участие коингибиторных рецепторов PD-1 и Tim-3 в патогенезе аллергических заболеваний изучено недостаточно. Поскольку данные рецепторы являются негативными регуляторами сигнала от Т-клеточного рецептора, их участие в развитии иммунного ответа при аллергических заболеваниях может иметь существенное значение. Поэтому целью данной работы было исследовать уровень экспрессии коингибиторных рецепторов PD-1 и Tim-3 на CD4⁺ и CD8⁺Т-клетках, а также экспрессию PD-1 на аллерген-специфических Th2A-клетках при аллергической бронхиальной астме и аллергическом рините.

Материалы и методы

В исследование вошли 7 пациентов с аллергической БА вне обострения (средний возраст 43±13,7 года, 5 женщин и 2 мужчин), 10 пациентов с АР (средний возраст 34±7,7 года, 4 женщины и 6 мужчин) и 14 условно-здоровых доноров (средний возраст 35±9,4 лет, 6 женщин и 8 мужчин). Набор в исследование осуществлялся после подписания информированного согласия. Пациенты с АР и БА получали АСИТ в отделении аллергологии клиники иммунопатологии НИИФКИ (г. Новосибирск), забор крови от пациентов осуществлялся до начала АСИТ в состоянии ремиссии заболевания. Пациенты преимущественно имели поливалентную сенсибилизацию, по степени контроля, определяемой согласно опроснику ACQ5 для пациентов с астмой и опроснику RCAT для пациентов с АР, характеризовались частично контролируемым течением астмы (1,4±0,5 балла) и неконтролируемым течением ринита (20±1,9 баллов).

Получение клеток периферической крови и подготовка клеток для цитометрического анализа

Выделение мононуклеарных клеток (МНК) осуществляли методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (p = 1,082 г/л) (BioClot GmbH, Германия).

МНК периферической крови после выделения в градиенте фиколл-урографина окрашивали только моноклональными антителами (BioLegend, США) против поверхностных маркеров: CD3-PE/Cy7, CD4-APC/Cy7, PD-1-APC, Tim-3-PerCP). Для определения негативной популяции для PD-1 и Tim-3 использовали FMO (Fluorescence Minus One) контроль, т. е. клетки окрашивали всеми антителами из панели, за исключением антител к PD-1 и Tim-3. Аллерген-специфические Th2A-клетки фенотипировали как CD4⁺CD45RO⁺CD27^-CRTh2⁺CD161⁺ лимфоциты, для этого МНК окрашивали моноклональными антителами (BioLegend, США) против соответствующих антигенов (CD4-FITC, CD45RO-PE/Cy7, CD27-APC/Cy7, CRTh2-APC, CD161-PE, PD-1-PerCP).

Анализ проводили на проточном цитофлуориметре FACS CantoII (Becton Dickinson, США) в программном обеспечении FACS Diva 6.0 (Becton Dickinson, США).

Статистическая обработка

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 (Statsoft, США) и GraphPadPrism 9 (GraphPad Software, США). Поскольку распределение показателей не всегда соответствовало нормальному распределению, согласно критерию Шапиро–Уилка, применялись методы непараметрической статистики. Для сравнения несвязанных переменных использовали критерий Манна–Уитни. Выявленные отличия считали достоверными при уровне значимости p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Пациенты с АР характеризовались сниженным числом клеток с фенотипом CD4⁺Tim-3⁺ в крови относительно показателей доноров. В популяции CD8⁺ клеток у пациентов с АР была выявлена тенденция (с уровнем статистической значимости p = 0,07) к снижению числа клеток, экспрессирующих только Tim-3 и одновременно Tim-3 и PD-1. В группе пациентов с БА не было выявлено значимых отличий по сравнению с группой доноров (табл. 1).

 

ТАБЛИЦА 1. ЭКСПРЕССИЯ PD-1 И Tim-3 НА CD4⁺ И CD8⁺Т-КЛЕТКАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ИНДИВИДУУМОВ И ПАЦИЕНТОВ С АЛЛЕРГИЧЕСКИМ РИНИТОМ И АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 1. PD-1 AND Tim-3 EXPRESSION ON CD4⁺ AND CD8⁺T CELLS FROM PERIPHERAL BLOOD OF HEALTHY INDIVIDUALS AND PATIENTS WITH ALLERGIC RHINITIS AND ALLERGIC BRONCHIAL ASTHMA, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Клеточная субпопуляция, % Cell population, %	Контроль Control (n = 14)	АР AR (n = 10)	БА BA (n = 7)
CD4+PD-1+	11,5 (7,7-14,6)	11,2 (8,9-17,8)	12,4 (8,3-20,5)
CD4+DP	0,2 (0,1-0,6)	0,1 (0,1-0,1)	0,1 (0,1-0,6)
CD4+Tim-3+	0,45 (0,15-1,20)	0,2 (0,1-0,2)*	0,2 (0,1-0,6)
CD8+PD-1+	12,4 (9,4-17,3)	15,45 (8,4-19,2)	10,9 (9,9-19,2)
CD8+DP	0,15 (0,1-0,3)	0,1 (0,0-0,1)	0,1 (0,0-0,1)
CD8+Tim-3+	0,6 (0,25-1,15)	0,3 (0,2-0,3)	0,5 (0,1-0,9)

Примечание. АР – аллергический ринит, БА – бронхиальная астма; * – достоверное отличие по сравнению с группой контроля (здоровые индивидуумы), критерий Манна–Уитни (p < 0,05). За 100% принято число CD4⁺/CD8⁺Т-клеток.

Note. AR, allergic rhinitis; BA, bronchial asthma; *, significant difference compared to control group, Mann–Whitney test (p < 0,05). The number of CD4⁺/CD8⁺T cells was taken as 100%.

 

Мы определили долю аллерген-специфических Th2A-клеток (CD4⁺CD45RO⁺CD27^-CRTh2⁺CD161⁺) как среди популяции CD4⁺ лимфоцитов, так и среди клеток памяти с фенотипом CD4⁺CD45RO⁺CD27^-. Достоверные отличия были выявлены в группе пациентов с АР и с БА по сравнению с группой доноров (табл. 2).

 

ТАБЛИЦА 2. СОДЕРЖАНИЕ Th2A-КЛЕТОК И ЭКСПРЕССИЯ НА НИХ PD-1 В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ИНДИВИДУУМОВ И ПАЦИЕНТОВ С АЛЛЕРГИЧЕСКИМ РИНИТОМ И АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 2. CONTENT OF Th2A CELLS AND THEIR EXPRESSION OF PD-1 IN THE PERIPHERAL BLOOD OF HEALTHY INDIVIDUALS AND PATIENTS WITH ALLERGIC RHINITIS AND ALLERGIC BRONCHIAL ASTHMA, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Клеточная субпопуляция, % Cell population, %	Контроль Control (n = 14)	АР AR (n = 10)	БА BA (n = 7)
Th2A (из гейта CD4+ клеток) Th2A (from the gate of CD4+ cells)	0,1 (0,1-0,2)	0,5 (0,3-0,8)*	0,7 (0,4-0,9)*
Th2A (из гейта CD4+CD45RO+CD27- клеток) Th2A (from the gate of CD4+CD45RO+CD27- cells)	1,1 (0,5-1,3)	3,3 (2,2-3,7)*	4,6 (3,7-8,5)*
PD-1+Th2A	4,2 (0,0-11,7)	4,9 (2,0-6,7)	11,8 (4,8-14,7)

Примечание. См примечание к таблице 1. За 100% принято число клеток в гейте.

Note. As for Table 1. The number of gated cells was taken as 100%.

 

По экспрессии PD-1 Th2A-клетки у доноров и пациентов не отличались. Однако была выявлена тенденция (с уровнем статистической значимости p = 0,057) к меньшему количеству аллерген-специфических PD-1⁺Th2A-клеток у пациентов с АР относительно пациентов с БА (табл. 2).

По результатам представленного исследования, у пациентов с БА и АР вне сезона поллинации в периферической крови не было изменено число CD4⁺ и CD8⁺ клеток отдельных популяций, экспрессирующих молекулы PD-1 по сравнению с контролем. Снижение CD4⁺ клеток, экспрессирующих Tim-3, наблюдалось только в группе пациентов с АР. В более раннем исследовании было показано, что пациенты с астмой характеризовались повышенным процентом и абсолютным числом как двойных-позитивных по Tim-3 и PD-1 CD4⁺T-клеток, так и клеток с фенотипами CD4⁺Tim-3⁺ и CD4⁺PD-1⁺ [9]. В другом исследовании, посвященном АР, экспрессия PD-1 на Th2-клетках также была увеличена, как в модели овальбумин-индуцированного АР у мышей, так и у пациентов с АР в сезон и вне сезона поллинации [10]. Предположительно, такие результаты связаны с тем, что пациенты во время исследования находились вне обострения, и, несмотря на частичную степень контроля над астмой, не было выявлено значительных отличий. Также сниженное количество регуляторных молекул на Т-лимфоцитах может быть обусловлено приемом системных глюкокортикостероидов, что в целом влияет и на общее число лимфоцитов.

Уровень экспрессии PD-1 на Th2A-клетках значительно не различался в группах доноров и пациентов, хотя, как было показано ранее, содержание PD-1⁺Th2-клеток было выше у пациентов с АР по сравнению со здоровыми донорами [10]. При этом, так же как и в нашем исследовании, количество PD-1 экспрессирующих Th2A-клеток было выше у пациентов с аллергической БА по сравнению с пациентами с АР, а уровень экспрессии PD-1 на клетках сохранялся у пациентов после проведения АСИТ.

В нашем исследовании у пациентов с аллергопатологией вне сезона поллинации процент аллерген-специфических клеток был выше, чем у здоровых индивидуумов, что соответствует данным исследования Wambre и соавт. [8]. Можно сказать, что Th2A-клетки вносят значимый вклад в патогенез аллергических заболеваний, а также могут стать перспективным маркером для диагностики и оценки эффективности терапии, в частности АСИТ, что нуждается в последующем исследовании.

Заключение

Таким образом, в нашем исследовании было показано, что вне обострения у пациентов с АР и БА экспрессия PD-1 на субпопуляциях Т-клеток периферической крови находится на уровне показателей здоровых индивидуумов. И даже несмотря на то, что содержание аллерген-специфических Тh2A-клеток у пациентов с АР и БА было повышено относительно группы контроля, уровень экспрессии PD-1 на Th2A-клетках также был в пределах нормативного показателя. Что может предполагать, что PD-1 может выступать не только как маркер «истощения», но и отражать статус активации различных субпопуляций Т-клеток, в том числе аллерген-специфических Th2A-клеток.

About the authors

Elena A. Blinova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Author for correspondence.
Email: blinovaelena-85@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3327-3630

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Clinical Immunopathology, Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Russian Federation, Novosibirsk

Victoria A. Galdina

Novosibirsk National Research State University

Email: vikagaldina@gmail.com

Student, Novosibirsk National Research State University

Russian Federation, Novosibirsk

Natalia M. Sukhova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: suchovanatalia@yandex.ru

Clinical Resident, Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Russian Federation, Novosibirsk

Darja V. Demina

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: immunology@mail.ru

PhD (Medicine), Head, Department of Allergology, Clinic of Immunopathology, Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Russian Federation, Novosibirsk

References

Supplementary files