Secretory IgA in patients with COVID-19 at different regimens of using multicomponent vaccine Immunovac-VP-4

Full Text

Введение

Иммунитет слизистых оболочек выполняет важнейшую функцию в профилактике респираторных инфекций, к которым относится и возбудитель новой коронавирусной инфекции. Можно предположить, что индукция иммунитета слизистой оболочки в перспективе станет одной из стратегий в вакцинопрофилактике и терапии конкретной инфекции, например, SARS-CoV-2. Активация синтеза sIgA в назальном секрете может способствовать усилению механизмов мукозального иммунного ответа и благоприятному течению и исходу COVID-19. Согласно результатам ранее проведенных клинических исследований, большинство иммуномодулирующих препаратов микробного происхождения демонстрируют высокую безопасность и снижение активности проявлений инфекций дыхательных путей. В ряде случаев их применение позволяет снизить количество назначаемых антибиотиков и других препаратов с сохранением эффективности терапии [3]. Считается, что распознавание дендритными клетками бактериальных антигенов в составе подобных препаратов приводит к активации иммунного ответа и выработке антител В-клетками, при этом повышается фагоцитарная активность макрофагов, полиморфноядерных нейтрофилов, увеличивается продукция лизоцима и секреторного компонента IgA (sIgA) [4]. Введение иммуномодуляторов бактериальной природы приводит к поляризации иммунного ответа, преимущественно по Th1-типу, отмечается повышение цитотоксичности NK-клеток, увеличение экспрессии TLR-2, TLR-4 и TLR-9 [2]. Высказываются предположения, что назначение бактериальных лигандов в комплексной терапии позволяет поддерживать повышенное содержание sIgA на период лечения [8], а активация синтеза sIgA, выявляемого в назальном секрете, может способствовать усилению механизмов мукозального иммунного ответа и благоприятному течению и исходу COVID-19.

Таким образом, поиск подходов к активации синтеза постинфекционных антител посредством коррекции факторов врожденного и адаптивного иммунитета на уровне слизистых оболочек респираторного тракта у пациентов с инфекцией, вызванной новым коронавирусом, может оказаться актуальным в лечении пациентов с COVID-19 [7].

Цель исследования – изучение концентрации sIgA в верхних отделах респираторного тракта у пациентов с подтвержденным диагнозом «коронавирусная инфекция, вызванная вирусом COVID-19» и анализ влияния иммуностимулирующего препарата бактериального происхождения на секрецию sIgA.

Материалы и методы

Инфекция SARS-CoV-2 подтверждалась методом ПЦР мазка из носоглотки. Отбор пациентов проводился после предварительно проведенных исследований и осмотра врача с учетом критериев включения и исключения. Вся информация о проведенном лечении, данных осмотра и проводимых исследованиях фиксировалась в официальной стандартной индивидуальной медицинской документации пациента.

Случайным образом пациенты были распределены на две группы: 1-я группа (n = 45), средний возраст: 45,2±13,8 года, мужчины/женщины (30/15), получали базисную терапию в соответствии с клиническими рекомендациями Минздрава Российской Федерации: «Временные методические рекомендации – профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)»; 2-я группа пациентов (n = 33), средний возраст 41,9±9,9 года, мужчины/женщины (24/9), дополнительно к базисной терапии получали иммуностимулирующий препарат бактериального происхождения – вакцину «Иммуновак-ВП-4», назначенную с первого дня госпитализации с учетом показаний и противопоказаний согласно инструкции к препарату.

Вакцина «Иммуновак-ВП-4» – вакцина из антигенов условно-патогенных микроорганизмов поликомпонентная (смесь водорастворимых антигенов микробных клеток Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli). Препарат разрешен к применению для назально-перорального введения ЛСР-001293/10 от 24.02.2010 (производство ФГУП «НПО «Микроген», г. Уфа, Россия). Препарат применялся по комбинированной схеме: интраназально, затем внутрь (per os): по 2 мл (20 мг) per os и по 2 капли (1 мг) интраназально в каждую половину носа ежедневно с 1-го по 10-й день нахождения в стационаре.

У всех больных оценивались демографические показатели, индекс массы тела, симптомы заболевания, данные объективного, лабораторного (общий анализ крови, С-реактивный белок, коагулограмма) и инструментального (компьютерная томография органов грудной клетки, пульсоксиметрия) методов исследования

Взятие биоматериала

У пациентов брались пробы: соскоб эпителиальных клеток со слизистой оболочки носовой полости, фарингеальный соскоб и секрет слюнных желез. Отбор слюны проводили ранним утром, перед чисткой зубов и приемом пищи. Слюну собирали при пассивном слюноотделении, без кашля под контролем врача [9, 10]. Забор биоматериала осуществлялся на 1-й день исследования до начала терапии, на 14-й день исследования перед выпиской из стационара и через 30 дней от начала терапии.

Уровни sIgA во всех биологических жидкостях были исследованы с помощью метода тверднофазного иммуноферментного анализа (АО «Вектор-Бест», Россия). Регистрацию результатов проводили на иммуноферментном фотометре микропланшетного типа Мультискан Ascent (Thermo Еlectron Сorporation, Финляндия). Метод определения основан на двухстадийном «сэндвич»-методе твердофазного иммуноферментного анализа с применением моноклональных антител к секреторному компоненту а-цепи IgA. Калибровочные пробы с известной концентрацией slgA и анализируемые образцы инкубируются в лунках планшета с иммобилизованными моноклональными антителами к slgA. Степень окраски пропорциональна концентрации slgA в анализируемом образце. После измерения величины оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывалась концентрация slgA в анализируемых образцах.

Работа выполнена с использованием сертифицированного оборудования центра коллективного пользования ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова».

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica для Windows 10.0 и Microsoft Excel 2007. Различия считались статистически достоверными при p < 0,05.

Протокол исследования был утвержден 26 ноября 2020 г. локальным Этическим комитетом ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» (Россия).

Результаты и обсуждение

Клиническое наблюдение за пациентами не позволило зарегистрировать развитие какие-либо системных или местных реакций, связанных с приемом препарата «Иммуновак-ВП-4».

Уровень sIgA в группе госпитализированных пациентов с COVID-19, получавших только базисную терапию, и в группе пациентов, получавших базисную терапию, дополненную «Иммуновак-ВП-4», представлен в таблице 1. Динамика уровня sIgA в назальном соскобе пациентов с пневмонией средней тяжести статистически значимо различалась в зависимости от применяемой терапии (F = 7,9, p (78,0) < 0,001) (рис. 1). Через 14 дней после начала наблюдения данный показатель в группе контроля статистически значимо снизился относительно исходных значений (с 96,3 (58,6-167,5) мкг/л до 59,0 (21,9-138,1) мкг/л, p = 0,02), в то время как в группе пациентов, получавших «Иммуновак-ВП-4» дополнительно к базовой терапии, уровень sIgA в указанный период оставался без изменений (p = 0,07). Через 30 дней после начала лечения уровень sIgA в группе пациентов, получавших «Иммуновак-ВП-4», статистически значимо вырос, как по сравнению с исходными значениями (с 77,7 (40,5-98,7) мкг/л до 113,4 (39,8-156,7) мкг/л, p = 0,05), так и по сравнению со значениями, измеренными на 14-й день лечения (с 60,2 (23,3-102,9) мкг/л до 113,4 (39,8-156,7) мкг/л, p = 0,03). В контрольной группе на 30-й день наблюдения уровень sIgA в назальной полости, напротив, статистически значимо снизился до 37,3 (8,4-66,9) мкг/л (с 99,9 (58,6-178,0) мкг/л исходно – p = 0,007 и с 59,0 (21,9-138,1) мкг/л на 14-й день лечения – p = 0,04). Таким образом, относительно исходных значений, через 30 дней после начала лечения уровень sIgA в назальной области в группе контроля снизился на 60 (от -115,4 до -3,5) мкг/л, а в группе «Иммуновак-ВП-4» вырос на +22,1 (от +1,8 до 89,8) мкг/л, различия дельты показателя между группами статистически значимы (p = 0,003). В результате данных изменений, через 30 дней после начала лечения, уровень sIgA в группе пациентов, получавших ВП-4 дополнительно к базовой терапии, стал статистически значимо выше, чем у пациентов, получавших только базовую терапию: 113,4 (39,8-156,7) мкг/л против 37,3 (8,4-66,9) мкг/л, p = 0,05. Относительно нормативных значений уровень sIgA в назальной полости у пациентов, получавших ВП-4, был выше в течение всего периода наблюдения (p < 0,001 исходно, p = 0,03 через 14 суток, p = 0,01 через 30 суток).

 

ТАБЛИЦА 1. АНАЛИЗ ДИНАМИКИ УРОВНЯ sIgA В ГРУППАХ СРАВНЕНИЯ У ПАЦИЕНТОВ C COVID-19 И ПОРАЖЕНИЕМ ЛЕГКИХ СРЕДНЕЙ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 1. ANALYSIS OF THE DYNAMICS OF sIgA LEVELS IN COMPARISON GROUPS IN PATIENTS WITH COVID-19 AND MODERATE LUNG DAMAGE, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Группы исследования Research groups	sIgA в контрольных точках, мкг/л sIgA at control points, µg/L			p-динамика5 p dynamics5
	До Before	Через 14 дней 14 days after	Через 30 дней 30 days after
Назальный соскоб – норма 29,9 мкг/л Nasal scraping – the norm is 29.9 µg/L
Контроль1 Control1	96,3 (58,6-167,5,0)	59,0 (21,9-138,1)	37,3 (8,4-66,9)	p0-14 = 0,02 p14-30 = 0,04 p0-30 = 0,007
ВП-42 VP-42	77,7 (48,4-98,7)	60,2 (23,3-102,9)	113,4 (39,8-156,7)	p0-14 = 0,07 p14-30 = 0,03 p0-30 = 0,05
p-группа p group	p = 0,14	p = 0,23	p = 0,02	–
LMEM3 – Группа: F = 0,8, p (78,0) = 0,44, Время: F = 0,6, p (45,9) = 0,43, Группа × Время: F = 7,9, p (78,0) < 0,001 LMEM3 – Group: F = 0.8, p (78.0) = 0.44, Time: F = 0.6, p (45.9) = 0.43, Group × Time: F = 7.9, p (78.0) < 0.001
Фарингеальный соскоб – норма 6,5 мкг/л Pharyngeal scraping – the norm is 6.5 µg/L
Контроль Control	6,6 (1,3-37,9)	5,3 (0,3-16,4)	2,9 (0,4-14,8)	p0-14 = 0,17 p14-30 = 0,36 p0-30 = 0,12
ВП-4 VP-4	1,5 (0,2-16,5)	5,7 (0,4-13,5)	29,8 (3,6-106,8)	p0-14 = 0,22 p14-30 = 0,07 p0-30 = 0,02
p-группа p group	p = 0,12	p = 0,45	p = 0,05	–
LMEM4 – Группа: F = 0,3, p (49,4) = 0,57, Время: F = 1,8, p (73,0) = 0,17, Группа × Время: F = 6,5, p (73,0) = 0,003 LMEM4 – Group: F = 0.3, p (49.4) = 0.57, Time: F = 1,8, p (73.0) = 0.17, Group × Time: F = 6.5, p (73.0) = 0.003
Секрет слюнных желез – норма 71,7 мкг/л Secret of the salivary glands is the norm of 71.7 µg/L
Контроль Control	169,4 (84,6-237,1)	130,6 (93,2-181,2)	126,7 (99,9-164,3)	–
ВП-4 VP-4	168,7 (95,8-233,8)	140,6 (86,4-213,4)	154,6 (121,0-200,3)	–
LMEM – Группа: F = 0,2, p (41,6) = 0,65, Время: F = 0,7, p (66,3) = 0,52, Группа × Время: F = 0,3, p (66,3) = 0,75 LMEM – Group: F = 0.2, p (41.6) = 0.65, Time: F = 0.7, p (66.3) = 0.52, Group × Time: F = 0.3, p (66.3) = 0.75

Примечание. ¹ – группа базисной терапии. ² – группа базисной терапии + «Иммуновак-ВП-4» (ВП-4). ³ – применялась смешанная линейная модель, где группа и время – фиксированные факторы, отдельные пациенты – случайные. Представлены результаты, обобщенные для трех временных точек с применением ANOVA (III тип) с аппроксимацией степеней свободы методом Кенварда–Роджера. ⁴ – расчеты проводились на предварительно трансформированных данных, применялся метод Бокса–Кокса, параметр λ = -0,13. ⁵ –апостериорные тесты (между контрольными точками – «p-динамика» и между группами в каждой контрольной точке – «p-группа») проводились с помощью построения соответствующих контрастов в рамках рассчитанной смешанной линейной модели, применялась поправка Бенджамина–Крюгера–Иекутиели.

Note. ¹, group of basic therapy. ², group of basic therapy + Immunovac-VP-4 (VP-4). ³, a mixed linear model was used, where the group and time are fixed factors, individual patients are random. The results generalized for three time points using ANOVA (type III) with approximation of degrees of freedom by the Kenward–Roger method are presented. ⁴, calculations were carried out on pre-transformed data, the Box–Cox method was used, the parameter λ = -0.13. ⁵, a posteriori tests (between control points – “p dynamics” and between groups at each control point – “p group”) were carried out by constructing appropriate contrasts within the framework of the calculated mixed linear model, the Benjamin–Kruger–Iekutieli correction was applied.

 

Рисунок 1. Динамики уровня sIgA в назальном соскобе в группе пациентов с пневмонией средней степени тяжести, получавших только базисную терапию и группе пациентов получавших базисную терапию, дополненную «Иммуновак-ВП-4» (исходно, через 14 и 30 дней), приведены индивидуальные значения, медиана, интерквартильный размах, минимальное и максимальное значение

Примечание. * – p ≤ 0,05, ** – p < 0,01 применялась линейная смешанная модель, для множественных сравнений применялась коррекция Бенджамина–Крюгера–Иекутиели; ## – p < 0,01, ### – p < 0,001 по сравнению с нормой (здоровыми непривитыми участниками исследования) применялся одновыборочный критерий Вилкоксона.

Figure 1. Dynamics of the level of sIgA in nasal scraping in a group of patients with moderate pneumonia receiving only basic therapy and a group of patients receiving basic therapy supplemented with Immunovac-VP-4 (initially, after 14 and 30 days), individual values, median, interquartile range, minimum and maximum values are given

Note. *, p ≤ 0.05; **, p < 0.01 a linear mixed model was used, the Benjamin–Kruger–Iekutieli correction was used for multiple comparisons; ##, p < 0.01; ###, p < 0.001 compared to the norm (healthy unvaccinated study participants), a single-sample Wilcoxon criterion was used.

 

Динамика уровня sIgA в фарингеальном соскобе статистически значимо отличалась или изменялась в зависимости от применяемой терапии (F = 6,5, p (73,0) = 0,003) (рис. 2). В группе пациентов, получавших только базовую терапию, динамика анализируемого показателя оставалась без статистически значимых изменений на всем периоде исследования (p = 0,17 через 14 суток, p = 0,12 через 30 суток относительно исходных значений). В то время как в группе пациентов, получавших базовую терапию, дополненную «Иммуновак-ВП-4», отмечается статистически значимый рост уровня sIgA в фарингеальной полости на 30-й день наблюдения относительно исходного уровня: с 1,5 (0,2-16,5) мкг/л до 29,8 (3,6-106,8) мкг/л (p = 0,02). Изменение дельта показателя на 30-й день по сравнению с исходным уровнем в группе «Иммуновак-ВП-4» составило +27,8 (от +0,3 до +221,7) мкг/л против -0,5 (от -14,2 до +2,8) мкг/л в группе контроля (p = 0,003). В результате описанных изменений уровень sIgA в фарингеальном соскобе через 30 дней после начала терапии стал статистически значимо выше в группе пациентов, получавших «Иммуновак-ВП-4», по сравнению с группой контроля: 29,8 (3,6-106,8) мкг/л против 2,9 (0,4-14,8) мкг/л (p = 0,05). По сравнению с нормативными значениями статистически значимых отличий ни в одной группе исследования выявлено не было.

 

Рисунок 2. Динамики уровня sIgA в фарингеальном соскобе в группе пациентов с пневмонией средней степени тяжести, получавших только базисную терапию и группе пациентов получавших базисную терапию, дополненную ВП-4 (исходно, 14 и через 30 дней), приведены индивидуальные значения, медиана, интерквартильный размах, минимальное и максимальное значение

Примечание. * – p ≤ 0,05 применялась линейная смешанная модель, для множественных сравнений применялась коррекция Бенджамина–Крюгера–Иекутиели.

Figure 2. Dynamics of the sIgA level in pharyngeal scraping in a group of patients with moderate pneumonia who received only basic therapy and a group of patients who received basic therapy supplemented with VP-4 (initially, 14 and after 30 days), individual values, median, interquartile range, minimum and maximum values are given

Note. *, p ≤ 0.05 a linear mixed model was used, the Benjamin–Kruger–Iekutieli correction was used for multiple comparisons.

 

Уровень sIgA в секрете слюнных желез статистически значимо не различался между группами исследования на всем периоде наблюдения (F = 0,2, p (41,6) = 0,65), динамика показателя в группах исследования также статистически значимо не различалась (F = 0,3, p (66,3) = 0,75).

Заключение

Индукция антител слизистой оболочки является ключевым компонентом в снижении выделения вируса после инфекции и может опосредовать защитный иммунитет после повторного воздействия. Разработка вакцин против SARS-CoV-1, нацеленных на слизистые оболочки, на моделях животных показали, что вирус-специфический IgA слизистых опосредует защиту от последующего воздействия CoV дикого типа [5, 6]. В проведенном исследовании был доказан положительный эффект терапии вакциной, содержащей антигенные компоненты Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli, обладающих иммуногенной активностью, который по результатам настоящего исследования характеризовался также восстановлением уровня sIgA в назальном и фарингиальном соскобе у пациентов, перенесших COVID-19. Быстрое восстановление одного из важных параметров – sIgA – мукозального иммунитета после перенесенной COVID-19 и создание защиты от любого патогена путем стимуляции системы врожденного иммунитета с помощью препаратов микробного происхождения, несущих консервативные, присущие только микроорганизмам патоген-ассоциированные молекулярные структуры, которые распознаются рецепторами иммунной системы, приводит к выявлению патогена (сигнал опасности), активации эффекторных механизмов защиты в течение нескольких часов и запуску процессов, ведущих к элиминации патогена и формированию протективного (адаптивного) иммунитета в течение 7-14 дней [1, 2]. Таким образом, результаты исследования показали, что для оценки состояния мукозального иммунитета у пациентов с COVID-19 целесообразно определять sIgA в назальном секрете. Назначенный в комплексной терапии иммуностимулирующий препарат микробного происхождения «Иммуновак-ВП-4» сопровождается повышением уровня sIgA на слизистых респираторного тракта и клиническим улучшением заболевания.

About the authors

M. P. Kostinov

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: monolit.96@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Head, Laboratory of Vaccination and Immunotherapy of Allergic Diseases, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Head, Department of Epidemiology and Modern Technologies of Vaccination, I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow; Moscow

N. D. Abramova

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: vaccinums@gmail.com

Junior Research Assistant, Laboratory of Molecular Immunology, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Russian Federation, Moscow

V. N. Osiptsov

c Main Military Clinical Hospital of the Russian National Guard Troops

Email: vaccinums@gmail.com

Lieutenant Colonel, Senior Therapist, Main Military Clinical Hospital of the Russian National Guard Troops

Russian Federation, Balashikha, Moscow Region

V. R. Tatevosov

c Main Military Clinical Hospital of the Russian National Guard Troops

Email: vaccinums@gmail.com

Lieutenant Colonel, Doctor-Therapist, Main Military Clinical Hospital of the Russian National Guard Troops

Russian Federation, Balashikha, Moscow Region

V. V. Gainitdinova

I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: vaccinums@gmail.com

PhD, MD (Medicine), Professor, Pulmonology Department, I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow

N. O. Kryukova

N. Pirogov Russian National Research Medical University

Email: vaccinums@gmail.com

Postgraduate Student, Assistant Professor, Department of Hospital Therapy, Faculty of Pediatrics, N. Pirogov Russian National Research Medical University

Russian Federation, Moscow

I. A. Baranova

N. Pirogov Russian National Research Medical University

Email: vaccinums@gmail.com

PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Hospital Therapy, Faculty of Pediatrics, N. Pirogov Russian National Research Medical University

Russian Federation, Moscow

E. A. Khromova

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: vaccinums@gmail.com

PhD (Medicine), Research Associate, Laboratory of Vaccine Prevention and Immunotherapy of Allergic Diseases, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Russian Federation, Moscow

Elena S. Korovkina

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: eskorovkina@yandex.ru

PhD (Medicine), Senior Research Associate, Laboratory of Allergodiagnostics, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Russian Federation, Moscow

A. G. Chuchalin

N. Pirogov Russian National Research Medical University

Email: vaccinums@gmail.com

PhD, MD (Medicine), Professor, Full Member, Russian Academy of Sciences, Head, Department of Hospital Therapy, Faculty of Pediatrics, N. Pirogov Russian National Research Medical University

Russian Federation, Moscow

O. A. Svitich

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: vaccinums@gmail.com

PhD, MD (Medicine), Professor, Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Director, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Russian Federation, Moscow

K. V. Mashilov

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: k.v.mashilov@gmail.com

PhD (Medicine), Senior Research Associate, Laboratory of Vaccine Prevention and Immunotherapy of Allergic Diseases, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files