Characteristic changes of extracellular Dna levels, indices of netosis and inflammation in peripheral blood in patients with asthma

Full Text

Введение

В последние два десятилетия появилось достаточно много экспериментальных и клинических исследований, убедительно свидетельствующих о том, что содержание внеклеточной ДНК (внДНК) в плазме крови существенно изменяется при определенных патологических процессах и что этот показатель может быть использован как один из диагностических критериев в клинической практике. Наибольшее внимание исследователей, с этой точки зрения, было уделено таким социально значимым нозологиям, как онкологические заболевания, сепсис, осложнения при беременности и некоторые другие заболевания, в том числе и те, основой развития которых предполагаются патологические реакции иммунной системы [3, 6]. Наиболее детально было за эти годы изучено поведение обсуждаемого параметра при иммунопатологических процессах, играющих ключевые роли в развитии системной красной волчанки (СКВ) и ревматоидного артрита (РА). Во многих работах было показано, что уровень внДНК в крови пациентов с этими заболеваниями существенно превышает величину аналогичного показателя у здоровых лиц, использованных в качестве контроля, и достаточно тесно связан с клинической картиной заболевания, а также с ее динамикой в процессе лечения [6, 7, 9, 14].

Согласно работам, базирующимся на клинических данных, одним из наиболее частых патофизиологических процессов, сопровождаемых заметными изменениями уровня внДНК в плазме крови, можно считать системную реакцию воспаления [5, 12]. Ранее на экспериментальной модели нами было показано, что острый воспалительный ответ на экзогенный стимул (введение умеренной дозы ЛПС) приводит к закономерным изменениям содержания внДНК в крови подопытных животных [2], а в лабораторном обследовании пациентов с РА было установлено, что уровень внДНК в плазме является адекватным показателем интенсивности воспалительных процессов у индивидуальных больных и степени эффективности терапии, достаточно тесно коррелируя с общепринятыми клиническими критериями динамики воспалительных реакций при данном заболевании (DAS-28 и СРБ) [1].

Поскольку тяжесть проявлений болезни при РА определяется в основном выраженностью воспалительных изменений в суставах и, следовательно, тесно связана со сдвигом баланса хелперов в Th1-сторону, в то время как патогенез БА, по общепринятым представлениям, критически зависит от продукции специфических антител, контролируемой активированными Th2-лимфоцитами, представляет несомненный интерес исследовать уровень внДНК в крови больных БА и сопоставить его значения с другими лабораторными показателями и с клинической картиной болезни. Это и стало целью настоящей работы.

Материалы и методы

Характеристика пациентов

В данную работу были включены 20 пациентов с бронхиальной астмой (БА), находившиеся на стационарном лечении в аллергологическом отделении клиники иммунопатологии НИИФКИ (г. Новосибирск). Право на участие в исследовании подтверждалось письменным информированным согласием. Протокол обследования был одобрен локальным этическим комитетом.

Исследованная группа состояла из 12 женщин (60%) и 8 мужчин (40%) в возрасте от 27 до 59 лет. По длительности заболевания от 1 года до 40 лет. Забор крови производился двукратно: в момент поступления и через 10 дней со дня госпитализации.

В исследование включены 10 образцов от условно здоровых доноров, набранных на Пункте забора донорской крови ГКБ № 1 г. Новосибирска.

Методы исследования

Выделение внеклеточной ДНК

Забор периферической крови для проведения анализа осуществлялся с помощью венозной пункции в вакуумную пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА).

Плазму отделяли от форменных элементов центрифугированием при 400 g в течение 20 мин [11]. Выделение внеклеточной ДНК из плазмы проводили на колонках компании «БиоСилика» (г. Новосибирск) согласно инструкции по применению «Набора для выделения ДНК из плазмы крови». Для определения внДНК, связанной с клеточной поверхностью, клетки инкубировали 5 мин с 0,25%-ным раствором трипсина, реакцию останавливали добавлением ингибитора трипсина из соевых бобов (Sigma, США) и центрифугированием отделяли супернатант, содержащий внДНК. Определение ДНК проводили с помощью флюоресцентного красителя PicoGreen (Invitrogen). Концентрация ДНК пересчитывалась по калибровочной кривой, построенной для известных концентраций стандартной двуцепочечной ë ДНК.

Выделение нейтрофилов

Периферическую кровь у доноров и пациентов с ревматоидным артритом забирали в утренние часы натощак в пропиленовые пробирки с гепарином (20 ME/мл крови). Нейтрофилы выделяли с помощью центрифугирования в двойном градиенте плотности фиколл-урографин (ρ = 1,077 г/см³ и ρ = 1,119 г/см³) при 400 g 25 мин. Полученное кольцо нейтрофилов переносили в пробирки и трижды отмывали в 5 мл PBS, центрифугируя при 200 g 10 минут, а затем ресуспендировали в культуральной среде, включающей RPMI-1640 без фенолового красного с добавлением 1%-ной инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки. Нейтрофильные лейкоциты составляли более 98% во фракции выделенных клеток, а их жизнеспособность составляла 99%, что определялось тестом с трипановым синим.

Определение спонтанного и стимулированного нетоза нейтрофилов in vitro

Свежевыделенные нейтрофилы переносили в черный планшет в концентрации 2 × 10⁵ клеток на лунку и часть из них стимулировали добавлением форболмиристат-ацетата (Sigma-Aldrich, Франция) до концентрации 50 nM, с последующим культивированием при 37 °С в атмосфере 5% CO₂ в течение 3 часов. Затем в лунки вносили 5 µM Sytox Green (Invitrogen, США). Уровень флюоресценции регистрировали на ридере TristarTM LB941 BERTHOLD (Германия): длина волны возбуждения – 485 нм и длина волны излучения – 527 нм [4].

Определение миелопероксидазы

Концентрацию миелопероксидазы определяли иммуноферментным методом с помощью набора Human MPO ELISA kit (Hycult Biotech, Нидерланды).

Определение цитокинов

IL-8, IL-1β, TNFα в сыворотке крови определяли с помощью наборов АО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск), предназначенных для иммуноферментного анализа.

Статистическая обработка

Результаты в таблицах приведены в виде средних величин. Достоверность выявленных различий и величину связей между измеренными параметрами оценивали методами непараметрической статистики с использованием U-критерия Манна–Уитни, Т-критерия Вилкоксона и коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение

Измерение внДНК в плазме крови пациентов с БА показало, что величина этого параметра в момент госпитализации была существенно снижена по сравнению с контрольной группой условно здоровых доноров (табл. 1, верхняя строка, p < 0,05). Однако после интенсивного курса терапии средний уровень внДНК в плазме больных заметно возрастал и статистически достоверно не отличался от этого показателя в контроле.

 

ТАБЛИЦА 1. ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК, ПОКАЗАТЕЛИ НЕТОЗА И ИЗМЕНЕНИЕ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ В КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

TABLE 1. EXTRACELLULAR DNA, INDICATORS OF NETOSIS AND CHANGES OF PRO-INFLAMMATORY CYTOKINES IN THE BLOOD OF PATIENTS WITH ASTHMA

Параметры Parameters	Доноры Donors	Пациенты с астмой Patients with asthma
		До лечения Вefore treatment	После лечения Аfter treatment
внДНК, нг/мл cfDNA, ng/mL	2,39	0,87 (0,05)	2,63
Нетоз спонтанный Spontaneous netosis	961759	993033 (0,85)	1019155 (0,97)
Нетоз при стимуляции Netosis on stimulation	1422891	2180530 (0,0006)	1654284 (0,33)
Индекс стимуляции Stimulation Index	1,39	2,25 (0,000005)	1,61 (0,015)
Миелопероксидаза, нг/мл Myeloperoxidase, ng/mL	13,13	30,23 (0,0005)	36,25 (0,0004)
СРБ, мг/л CRP, mg/L	2,50	5,28	–
TNFα, пг/мл TNFα, pg/mL	0,69	3,32 (0,004)	0,93 (0,43)
IL-1β, пг/мл IL-1β, pg/mL	1,90	4,28 (0,14)	3,12 (0,25)
IL-8, пг/мл IL-8, pg/mL	3,31	6,33 (0,23)	6,71 (0,20)

Примечание. Полужирным шрифтом выделены достоверные различия с донорами (значения p приведены в скобках).

Note. Significant differences from donors are highlighted in bold (p values are in brackets).

 

Полученные нами результаты оказались совершенно неожиданными, поскольку в подавляющем большинстве исследований, описывающих изменения содержания внДНК в крови больных с самыми различными патологиями, указывается на существенное увеличение этого параметра по сравнению со здоровыми лицами, а данных, говорящих о его снижении при каких-либо воздействиях, в литературе найти не удалось. К сожалению, вопрос об уровне внДНК в крови при БА еще недостаточно изучен, и мы нашли лишь две опубликованные работы, в которых приведены результаты непосредственного измерения этого параметра у больных с БА. В первой не было обнаружено статистически достоверных изменений содержания внДНК при БА [10], в то время как в работе группы исследователей из Неаполя [13] было зарегистрировано небольшое повышение (на 5-10% по сравнению с контролем) данного показателя у пациентов с БА. Однако этот вывод об увеличении количества внДНК в крови больных вызывает определенные сомнения, поскольку указанный в цитируемой работе уровень внДНК у здоровых лиц (2,2 мкг/мл) более чем на два порядка превышает аналогичные данные в опубликованных работах других авторов. Следует полагать, что на сегодняшний день вопрос об уровне внДНК в крови пациентов с БА еще окончательно не прояснен и требует дальнейшего изучения и проверки.

Как уже отмечалось выше, содержание внДНК в крови изменяется при воспалительных реакциях в организме, и, по общепринятым представлениям, значительная часть этой ДНК может появляться в крови вследствие выхода во внеклеточное пространство при нетозе нейтрофильных лейкоцитов. Поэтому в нашем исследовании была дополнительно изучена способность нейтрофилов из периферической крови больных БА реагировать in vitro реакцией нетоза на экзогенный стимул (форболмиристат ацетат) и содержание миелопероксидазы в крови больных (специфический показатель интенсивности нетоза in vivo), а также определены концентрация C-реактивного белка (СРБ) и содержание провоспалительных цитокинов в крови. Результаты этих измерений представлены в таблице 1 и свидетельствуют, что больные БА (рассматриваемые как единая группа), не обнаруживают проявлений выраженной системной воспалительной реакции. Средний уровень СРБ у них практически не выходит за границы нормальных значений этого показателя, а содержание в крови провоспалительных цитокинов лишь умеренно повышено у них по сравнению с контрольной группой, и только уровень TNFα достоверно отличается от контроля. При этом уровень внДНК в плазме крови у индивидуальных больных не коррелирует ни с одним из измеренных цитокинов, ни с СРБ (коэффициенты ранговой корреляции для этих параметров близки к нулю). Исходя из полученных результатов, резонно предполагать, что наблюдаемые изменения уровня внДНК в плазме крови при БА не обусловлены хроническим воспалительным процессом в легких этих больных, а определяются некими иными патофизиологическими механизмами, природу и значение которых еще предстоит выяснить.

К несколько иному выводу приводят результаты определения степени активации нейтрофилов при БА. Хотя уровень спонтанного нетоза in vitro пациентов с БА и не отличался от величины этого параметра в контроле, примированность нейтрофилов из их периферической крови (т. е. величина ответа на экзогенный стимул) была достоверно увеличена по сравнению с этими показателями в контрольной группе. Этот факт хорошо согласуется с современными представлениями о роли нейтрофилов в патогенезе БА. При этом не обнаружено существенной корреляции между активностью нейтрофильных лейкоцитов и уровнем внДНК в плазме. Высокое содержание миелопероксидазы в крови больных БА прямо свидетельствует об активно происходящем нетозе нейтрофилов, но роль этого процесса в изменении уровня внДНК в плазме не очевидна, и значимой корреляции между этими параметрами не обнаруживается (ρ = 0,28, p > 0,05).

Ввиду уже отмеченной этиопатогенетической разнородности состояний у пациентов с бронхиальной астмой, нами была предпринята попытка сравнить средние величины измеренных параметров между фенотипическими формами БА, выделяемыми в клинике НИИФКИ на основании имеющихся клинических и лабораторных данных. Результаты такого сравнения даны в таблице 2.

 

ТАБЛИЦА 2. ИССЛЕДОВАННЫЕ ПАРАМЕТРЫ У БОЛЬНЫХ С РАЗЛИЧНЫМИ ФЕНОТИПИЧЕСКИМИ ФОРМАМИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ

TABLE 2. STUDIED PARAMETERS IN PATIENTS WITH DIFFERENT PHENOTYPIC FORMS OF ASTHMA

Параметры Parameters	Фенотипические формы БА Phenotypic form of asthma
	Экзогенная Exogenic (n = 7)	Смешанная Mixed (n = 8)	Эндогенная Endogenic (n = 5)
внДНК, нг/мл cfDNA, ng/mL	0,88	0,97	0,72
Связанная с поверхностью клетки внДНК, нг/мл Cell-surface-bound DNA, ng/mL	10,86	19,08	31,95
Нетоз при стимуляции Netosis on stimulation	2358146	2132084	2009382
Индекс стимуляции Stimulation Index	2,46	2,09	2,20
Миелопероксидаза, нг/мл Myeloperoxidase, ng/mL	28,86	36,00	23,50
Базофилы, % Basophils, %	0,57	0,25	0,00
Эозинофилы, % Eosinophils, %	4,71	2,63	1,80
Индекс N/L Index NRL	2,65	5,77	5,32
СРБ, мг/л CRP, mg/L	2,74	5,36	8,70
TNFα, пг/мл TNFα, pg/mL	2,41	4,15	4,85
IL-1β, пг/мл IL-1β, pg/mL	3,23	5,97	4,60
IL-8, пг/мл IL-8, pg/mL	5,20	8,72	5,50

 

Видно, что, если показатели активации и нетоза нейтрофилов не обнаруживают заметных межгрупповых различий, то содержание в крови базофильных и эозинофильных гранулоцитов, закономерно возрастающее при аллергических реакциях, оказывается наибольшим при экзогенной фенотипической форме БА, патогенез которой определяется аллергизацией в ответ на антигены, поступающие в организм из внешней среды. Хорошо согласуется с выделением этих клинических форм и тот факт, что относительно повышенные значения показателей воспалительной активности (СРБ, TNFα) выявляются у больных с эндогенной фенотипической формой БА, для которой характерно развитие хронического воспалительного процесса в дыхательных путях, в то время как в группе с экзогенной формой величина этих показателей минимальна. Это же можно заметить и относительно индекса N/L (т. е. соотношения между количеством нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови), который в последние годы все чаще используется в качестве диагностического критерия воспалительной активности [8]. К сожалению, малые размеры выделенных групп не позволяют говорить о достоверности наблюдаемых межгрупповых различий, однако явная закономерность вариации не одного, а одновременно многих параметров дает почти полную уверенность в реальном существовании различий по исследованным признакам между клиническими формами БА.

В связи с этим приобретает определенное значение тот любопытный факт, что, хотя по содержанию внДНК в плазме крови указанные группы практически не отличаются друг от друга, величина трипсиновой фракции внДНК (т. е. количество внДНК, ковалентно связанной с мембранами клеток крови и высвобождаемой в раствор только после кратковременной обработки трипсином) оказывается максимальной у больных с эндогенной формой БА и минимальной в группе с экзогенной фенотипической формой. Особенный интерес наблюдаемому феномену придает видимое сочетание относительно большой величины трипсиновой фракции внДНК с относительно увеличенными показателями воспалительной активности при эндогенной форме БА. На первый взгляд, это противоречит экспериментальным данным, полученным нами ранее [9], так как в этих экспериментах острая воспалительная реакция приводила не к увеличению, а к существенному уменьшению трипсиновой фракции. Можно предполагать, что такое «нелогичное» поведение внДНК у больных БА еще раз указывает на специфичность регуляции этого параметра при развитии данного заболевания.

Заключение

В заключение следует подчеркнуть, что обнаруженное в данном исследовании уменьшение содержания внДНК в плазме крови у пациентов с БА является единственным – на сегодняшний день – зафиксированным случаем угнетающего эффекта патологического процесса на этот параметр. Сущность такого воздействия еще не выяснена, но можно надеяться, что дальнейшие исследования позволят расшифровать физиологические механизмы, приводящие к возникновению подобных феноменов.

About the authors

Elena D. Gavrilova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Author for correspondence.
Email: edav.gavr@mail.ru

PhD (Biology), Head, Laboratory of Experimental Immunotherapy, Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Russian Federation, Novosibirsk

E. V. Goiman

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: l.goiman@mail.ru

PhD (Medicine), Research Associate, Laboratory of Experimental Immunotherapy, Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Russian Federation, Novosibirsk

E. N. Demchenko

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: elena.demchenko@gmail.com

PhD (Chemistry), Research Associate, Laboratory of Experimental Immunotherapy, Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Russian Federation, Novosibirsk

D. V. Demina

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: immunology@mail.ru

PhD (Medicine), Head, Department of Allergology, Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Russian Federation, Novosibirsk

N. N. Volskiy

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: dtheory@yandex.ru

PhD (Medicine), Leading Research Associate, Laboratory of Experimental Immunotherapy, Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Russian Federation, Novosibirsk

V. A. Kozlov

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: vakoz40@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Full Member, Russian Academy of Sciences, Research Director, Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Russian Federation, Novosibirsk

References

Supplementary files