Relationship of the phenotype of peripheral blood lymphocytes and signs of osteopenia in patients with chronic lymphocytic leukemia

Full Text

Введение

Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) – это злокачественная опухоль, возникающая из CD5⁺ В-лимфоцитов, экспрессирующих низкие уровни одного типа легкой цепи поверхностного мембранного иммуноглобулина, со значительным лимфоцитозом (≥ 5×10⁹/л моноклональных В-лимфоцитов). В России заболеваемость ХЛЛ в последние 5 лет составляет около 2,5 на 100 тыс., медиана возраста на момент установления диагноза – 68 лет [2]. В Челябинской области заболеваемость ХЛЛ в 2020 г. составила 3,01 на 100 тыс., в 2021 г. – 3,03. Клинические последствия клонального роста CD5⁺В-лимфоцитов очень разнообразны: некоторые пациенты умирают в течение 2-3 лет после постановки диагноза в связи с тяжестью течения самого ХЛЛ, осложнениями, а большинство живут десятилетиями от момента постановки диагноза, это заболевание стареющих взрослых, что делает его самым распространенным лейкозом среди взрослых в западных странах. ХЛЛ характеризуется развитием ряда осложнений и коморбидностью, к числу основных относят инфекционные, сердечно-сосудистые заболевания, нарушение функции щитовидной железы, язвенную болезнь желудка и/или двенадцатиперстной кишки и остеодеструктивный синдром, в том числе остеопороз [13]. Потеря костной массы выявляется у 49% пациентов с ХЛЛ, время от постановки диагноза ХЛЛ до выявления составляет в среднем 3,5 года. Риск возникновения остеопороза у пациентов ХЛЛ составляет 67% у всех возрастных групп, остеопороза составляет 14,7%, а остеопении – 10,2% [6, 12].

Исследования иммунологических аспектов ХЛЛ показали, что взаимодействия между стромальными и лейкемическими клетками способствуют выживанию и экспансии неопластического клона и одновременно влияют на функции клеток микроокружения, что может иметь значение в патогенезе снижения минеральной плотности костной массы (МПК) [14].

Цель работы – исследовать взаимосвязь между показателями иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови и показателями остеоденситометрии при ХЛЛ.

Материалы и методы

Исследование проведено на базе ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России и ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница». Под наблюдением находились 48 пациентов мужского пола с ХЛЛ в возрасте 50-70 лет, в том числе по классификации Binet [3]: 14 пациентов (29%) со стадией А, 24 пациента (50%) со стадией В, 10 пациентов (21%) со стадией С. Средняя продолжительность болезни составила 10,5 месяцев. Диагноз верифицировали методом иммунофенотипирования опухолевого клона лимфоцитов. На проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II (BD Biosciences, США) с помощью тест-системы Becton Dickinson and Company (США) в периферической крови дифференцировали опухолевые лимфоциты по наличию экспрессии CD5⁺, CD19⁺, CD20⁺, CD22⁺, CD23⁺, CD43⁺, CD200⁺. Для оценки вероятности перелома использован международный опросник FRAX (Fracture Risk Assessment Tool) [1]. Остеоденситометрия проведена на денситометре DEXXUM 3 (OsteoSys Co, Южная Корея) с оценкой МПК (г/см²), Т-показателя (стандартное отклонение, SD), Z-показателя (SD) в поясничном отделе позвоночника (ПОП), шейке проксимального отдела бедренной кости (ШПОБК), проксимальном отделе бедренной кости (ПОБК). В зависимости от показателей остеодинситометрии пациентов разделили на две группы: группу 2 (n = 34), которые не имели отклонений МПК (Т- и Z-показатель > – 1,0 SD) и группу 3 (n = 14) с признаками ОП (Т- и Z-показатель от – 1,0 SD до – 2,5 SD). Возраст пациентов в группе 2 (61,0 (59,0-65,0) года) и в группе 3 (62,0 (57,0-66,0) года) был сопоставим (р > 0,05). Группа 1 (n = 14) – условно здоровые мужчины, сопоставимые по возрасту с группами 2 и 3, медиана возраста составила 59,0 (54,7-61,5) года. Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программного пакета IBM SPSS Statistics v. 23 (SPSS: An IBM Company, США). Характеристика выборок представлена в формате Me (Q_0,25-Q_0,75), где Мe – медиана, Q_0,25 и Q_0,75 – значения нижнего и верхнего квартилей соответственно. Для оценки распределения непрерывных переменных использован тест Шапиро–Уилка. Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием критерия Манна–Уитни. Для выявления связи между показателями использовали коэффициент корреляции Спирмена (R). Отличия считали статистически значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение

Оценка костной ткани методом остеоденситометрии у больных ХЛЛ позволила сформировать 2 группы и выявить признаки остеопении у части больных на основании оценки Т-показателя как минимум в одной из исследуемых областей костной ткани (табл. 1).

 

Таблица 1. Показатели остеоденситометрии у больных с ХЛЛ, Ме (Q_0,25-Q_0,75)

Table 1. Osteodensitometry indices in patients with CLL, Ме (Q_0.25-Q_0.75)

Показатели Indicators	Группа 1 Group 1 (n = 14)	Группа 2 Group 2 (n = 34)	Группа 3 Group 3 (n = 14)
Т-кр. ПОП, SD T-sc. LS, SD	0,70 (-1,30-1,20)	1,00 (-0,10-2,60)	-0,30 (-1,30-1,00)#
Z-кр. ПОП, SD Z-sc. LS, SD	0,90 (-1,00-1,70)	1,30 (0,40-2,90)	0,25 (-1,10-1,40)#
МПК ПОП, г/см2 BMD LS, g/cm2	1,304 (1,068-1,368)	1,373 (1,214-1,518)	1,188 (1,064-1,346)#
Т-кр. ШПОБК, SD T-sc. PFN, SD	-0,15 (-1,40-0,20)	-0,20 (-0,60-0,10)	-1,65 (-2,90 – -1,20)* #
Z-кр. ШПОБК, SD Z-sc. PFN, SD	0,50 (-0,60-1,00)	0,70 (0,40-1,00)	-0,80 (-1,00 – -0,40)* #
МПК ШПОБК, г/см2 BMD PFN, g/cm2	1,051 (0,885-1,101)	1,045 (0,997-1,081)	0,888 (0,806-0,930)* #
Т-кр. ПОБК, SD T-sc. PFB, SD	-0,10 (-1,60-0,20)	0 (-0,40-0,55)	-1,60 (-2,00 – -0,80)* #
Z-кр. ПОБК, SD Z-sc. PFB, SD	0,40 (-1,00 –0,80)	0,70 (0,30-1,30)	-0,65 (-1,30 – -0,10)* #
МПК ПОБК, г/см2 BMD PFB, g/cm2	1,076 (0,885-1,120)	1,093 (1,056-1,143)	0,980 (0,833-1,018)#

Примечание. * – статистически значимые (p < 0,05) различия с группой 1; ^# – с группой 2.

Note. *, statistically significant (p < 0.05) differences with group 1; ^#, with group 2.

 

Как известно, Т-показатель представляет стандартизированное отклонение МПК по сравнению со средним значением для того возраста, в котором МПК в данном участке скелета достигает максимума, т. е. сравнение с нормальной пиковой костной массой. Z-показатель представляет среднее значение МПК для данного возраста и пола, т. е. данные больного сравниваются с возрастной нормой. Согласно рекомендациям ВОЗ, у мужчин старше 50 лет для выявления снижения МПК должен использоваться преимущественно Т-показатель [1]. Отметим, что в группе 2 у больных ХЛЛ отсутствовали значимые изменения показателей остеоденситометрии по сравнению с контрольной группой здоровых лиц в ПОП, ШПОБК, ПОБК. В группе 3 наблюдается статистически значимое снижение МПК, Т- и Z-показателей в ПОП, ШПОБК, ПОБК. Кроме этого, в группе 3 по сравнению с контрольной группой здоровых лиц снижается МПК, Т- и Z-показатели в ПОП, ШПОБК, а также Т- и Z-показатели в ПОБК. Нами не обнаружено статистически значимых изменений (р > 0,05) показателя FRAX (%) в группах 2 (28,0 (26,5-30,5)) и 3 (28,7 (23,0-30,1)) по сравнению с группой 1 (28,5 (25,6-30,0)), а также между группой 2 и группой 3, что позволяет сделать вывод о том, что признаки остеопении в обеих группах не влияют на вероятность возникновения переломов костей. При исследовании популяционного состава лимфоцитов периферической крови нами обнаружены статистически значимые отличия всех показателей между группами 2 и 3 (табл. 2).

 

Таблица 2. Популяционный состав лимфоцитов в крови у больных с ХЛЛ, Ме (Q_0,25-Q_0,75)

Table 2. Population composition of lymphocytes in the blood of patients with CLL, Ме (Q_0.25-Q_0.75)

Показатели, × 109/л Indicators, × 109/L	Группа 2 Group 2 (n = 34)	Группа 3 Group 3 (n = 14)
CD5+	34,620 (16,720-79,100)	122,100 (57,664-151,670)*
CD19+	34,596 (14,009-74,195)	114,529 (45,241-139,840)*
CD20+	23,820 (15,912-53,940)	100,557 (52,926-119,232)*
CD22+	20,313 (12,974-39,391)	73,365 (66,734-94,357)*
CD23+	27,791 (16,653-65,811)	91,331 (55,815-144,238)*
CD43+	35,371 (17,534-83,891)	120,879 (55,064-150,911)*
CD200+	31,885 (19,166-89,315)	133,317 (89,641-150,760)*

Примечание. * – статистически значимые (p < 0,05) различия с группой 2.

Note. *, statistically significant (p < 0.05) differences with group 2.

 

Так, абсолютное количество CD5⁺ увеличилось по медиане в 3,6 раза, CD19⁺ – в 3,3 раза, CD20⁺ – в 4,2 раза, CD22⁺ – в 3,6 раза, CD23⁺ – в 3,4 раза, CD43⁺ – в 3,5 раза, CD200⁺ – в 4,2 раза. Наибольший прирост отмечен в отношении CD20⁺ и CD200⁺ клеток. Кроме того, необходимо отметить, что исследуемые количественные показатели популяционного состава лимфоцитов периферической крови в группе 2 (больные ХЛЛ без признаков остеопении) также возрастали по сравнению с референсными значениями для данной тест-системы и калибровки прибора. На следующем этапе в группе больных с ХЛЛ и признаками остеопении проведен корреляционный анализ между показателями иммунофенотипирования лимфоцитов и показателями остеоденситометрии двух областей скелета, в которых обнаружены признаки остеопении на основании оценки Т-показателя: ШПОБК, ПОБК. Результаты представлены в таблице 3.

 

Таблица 3. Корреляция между показателями остеопении и популяционным составом лимфоцитов в крови у больных с ХЛЛ

Table 3. Correlation between indicators of osteopenia and the population composition of lymphocytes in the blood in patients with CLL

Показатели Indicators	Т-пок. ШПОБК T-sc. PFN	Z-пок. ШПОБК Z-sc. PFN	МПК ШПОБК BMD PFN	Т-пок. ПОБК T-sc. PFB	Z-пок. ПОБК Z-sc. PFB	МПК ПОБК BMD PFB
CD5+	R = -0,75	R = -0,77	R = -0,75	R = -0,37	R = -0,49	R = -0,14
CD19+	R = -0,78	R = -0,82	R = -0,78	R = -0,37	R = -0,28	R = -0,03
CD20+	R = -0,67	R = -0,71	R = -0,67	R = -0,37	R = -0,05	R = -0,25
CD22+	R = -0,60	R = -0,60	R = -0,44	R = -0,30	R = -0,21	R = -0,31
CD23+	R = -0,75	R = -0,77	R = -0,30	R = -0,37	R = -0,49	R = -0,14
CD43+	R = -0,75	R = -077	R = -0,16	R = -0,45	R = -0,58	R = -0,14
CD200+	R = -0,60	R = -0,60	R = -0,60	R = -0,21	R = -0,49	R = -0,25

Примечание. R – коэффициент корреляции Спирмена, полужирным шрифтом отмечены статистически значимые (p < 0,05) связи.

Note. R, Spearman correlation coefficient; statistically significant (p < 0.05) relationships are indicated in bold.

 

Статистически значимые связи отсутствовали между количеством всех исследуемых популяций лимфоцитов и МПК в ПОБК, между CD19⁺, CD20⁺, CD22⁺ и Z-показателем в ПОБК, между CD22⁺, CD200⁺ и Т-показателем в ПОБК, CD23⁺, CD43⁺ и МПК в ШПОБК. Высокой силы обратная связь по шкале Чеддока обнаружена между CD5⁺, CD19⁺ и Т-показателем, Z-показателем, МПК в ШПОБК; CD20⁺ и Z-показателем в ШПОБК; CD23⁺, CD43⁺ и Т-показателем, Z-показателем в ШПОБК. Обратная связь средней силы зафиксирована между CD20⁺ и Т-показателем, МПК в ШПОБК; CD22⁺, CD200⁺ и Т-показателем, Z-показателем, МПК в ШПОБК; CD43⁺ и Z-показателем в ПОБК. Слабой силы обратная связь отмечена между CD5⁺, CD23⁺ и Т-показателем, Z-показателем в ПОБК; CD19⁺, CD20⁺, CD43⁺ и Т-показателем в ПОБК; CD200⁺ и Z-показателем в ПОБК. Принимая во внимание факт, что при оценке остеопении у данной категории больных с ХЛЛ необходимо ориентироваться преимущественно на Т-показатель, можно пренебречь связью между CD200⁺ и Z-показателем в ПОБК. Как видно, наибольшее количество и наиболее сильные связи выявлены между количеством в крови CD5⁺, CD19⁺, CD23⁺, CD43⁺ и Т-показателем, Z-показателем, МПК в ШПОБК.

Обнаруженные нами взаимосвязи между популяционным спектром лимфоцитов и показателями остеденситометрии у больных ХЛЛ с признаками остеопении могут быть связаны с изменением функциональной активности опухолевых клеток, что отражается экспрессией соответствующих рецепторов, CD-маркеров, а также их достаточно сложным взаимодействием с клетками микроокружения, в том числе клетками костной ткани. Так, экспрессия CD19⁺ высококонсервативна в большинстве В-клеточных опухолей и ассоциирована с выработкой аутоантител, текущей вирусной или недавней бактериальной инфекцией, лимфаденопатией. По данным ряда исследований, у больных остеопорозом зафиксировано увеличение экспрессии CD19⁺ на лимфоцитах крови, селезенки и костного мозга [7]. Наряду с традиционными маркерами В-лимфоцитов (CD5⁺, CD19⁺, CD20⁺, CD22⁺, CD23⁺) для диагностики ХЛЛ в пограничных случаях Международной рабочей группой по ХЛЛ и европейским консенсусом рекомендуется использовать CD43⁺, в частности для дифференциации между ХЛЛ и мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомой [11]. CD43⁺ – крупный сиалогликопротеин, экспрессируемый на поверхности большинства гемопоэтических клеток, участвует в реализации межклеточных контактов, передаче сигналов, адгезии и взаимодействии с микробами и паразитами в ходе воспалительного процесса, в регуляции синтеза активных форм кислорода, IFNγ и TNFα [5]. Провоспалительные цитокины IL-1β, IL-6, IL-11, TNFα, простагландин E2, высвобождаемые клетками ХЛЛ, увеличивают количество преостеокластов и резорбцию костей [9]. IL-1β индуцирует остеокластогенез, повышая экспрессию RANKL остеобластами, уровень склеростина, опосредует остеокластогенез, вызванный TNFα [10]. TNFα ингибирует экспрессию фактора дифференцировки остеобластов, связанного с Runt-доменом (RUNX2), дифференцировку остеобластов через ингибирование синтеза компонентов внеклеточного матрикса или снижение экспрессии остеокальцина и щелочной фосфатазы, увеличение уровня мРНК остеопонтина [9]. TNFα, высвобождаемый лейкемическими клетками, стимулирует остеокластогенез и дифференцировку остеокластов независимо от системы RANKL/RANK, последовательно активируя транскрипционные факторы NF-kB, c-Fos и NFATc1 [15]. Другие цитокины из клеток ХЛЛ, такие как IL-6 и IL-11, могут способствовать дифференцировке моноцитов и участвовать в избыточной стимуляции остеокластогенеза в отсутствие предварительной стимуляции RANKL.

В то же время дифференцированные остеокласты или их предшественники защищают лейкемические В-клетки от апоптоза и стимулируют их пролиферацию, тем самым активно взаимодействуя между собой. Установлена прямая корреляция между уровнем экспрессии RANKL на клетках ХЛЛ и степенью разрушения костной ткани у пациентов с ХЛЛ и в эксперименте на линии мышей с гиперэкспрессией RANK в лимфоцитах, полученных от людей с ХЛЛ [4]. Клетки ХЛЛ могут экспрессировать PTHrP, который в свою очередь повышает экспрессию RANKL на остеобластах, что приводит к дифференцировке многоядерных остеокластов из миелоидных предшественников, как следствие зрелые остеокласты резорбируют костный матрикс, позволяя опухолевым клеткам расти и мигрировать в тканях [8]. Взаимодействие RANKL-RANK активирует синтез остеокластами факторов роста, таких как инсулиноподобный фактор роста 1, которые стимулируют синтез пептидов паратиреоидного гормона, способствуют росту опухоли, а само взаимодействие между опухолевыми клетками и клетками костной ткани приводит к формированию порочного круга разрушения костей и роста опухоли.

Выводы

1. У больных с ХЛЛ при наличии признаков остеопении по показателям остеоденситометрии в ПОП, ШПОБК, ПОБК по сравнению с больными ХЛЛ без признаков остеопении наблюдается увеличение количества в крови лимфоцитов с фенотипом CD5⁺, CD19⁺, CD20⁺, CD22⁺, CD23⁺, CD43⁺, CD200⁺.
2. У больных с ХЛЛ признаки остеопении в ШПОБК нарастают по мере увеличения в крови CD5⁺, CD19⁺, CD20⁺, CD22⁺, CD23⁺, CD43⁺, CD200⁺, признаки остеопении в ПОБК нарастают по мере увеличения в крови CD5⁺, CD19⁺, CD20⁺, CD23⁺, CD43⁺; наиболее сильные связи обнаружены между количеством в крови CD5⁺, CD19⁺, CD23⁺, CD43⁺ и Т-показателем, Z-показателем, МПК в ШПОБК.

About the authors

M. V. Osikov

South Ural State Medical University; Chelyabinsk Regional Clinical Hospital

Author for correspondence.
Email: prof.osikov@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Head, Pathophysiology Department; Head, Scientific Department

Russian Federation, Chelyabinsk; Chelyabinsk

E. A. Korobkin

South Ural State Medical University; Chelyabinsk Regional Clinical Hospital

Email: prof.osikov@yandex.ru

Assistant, Pathophysiology Department; Hematologist

Russian Federation, Chelyabinsk; Chelyabinsk

A. A. Fedosov

P. Lumumba Peoples’ Friendship University of Russia

Email: prof.osikov@yandex.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Histology, Cytology and Embryology

Russian Federation, Moscow

G. P. Dimov

South Ural State Medical University

Email: prof.osikov@yandex.ru

PhD (Medicine), Research Associate, Head, department of Collection, Procurement and Storage of Hematopoietic Cells and Bone Marrow

Russian Federation, Chelyabinsk

References

Supplementary files