FEATURES OF MITOCHONDRIAL STATE IN CD4+ T-LYMPHOCYTE SUBSETS

Full Text

Введение

CD4⁺ Т-лимфоциты являются ключевыми координаторами адаптивного иммунного ответа. Пул циркулирующих в периферической крови CD4⁺ Т-клеток неоднороден и на основе экспрессии одной из изоформ общего лейкоцитарного антигена CD45 (CD45RA или CD45R0) и наличия хемокинового рецептора CCR7 может быть разделен на четыре субпопуляции [11]. Наивные лимфоциты экспрессируют высокие уровни CD45RA и CCR7 (CD45RA⁺CD45R0^–CCR7⁺). Приобретение клетками фенотипа памяти приводит к потере экспрессии CD45RA в лимфоцитах центральной памяти (CD45RA^–CD45R0⁺CCR7⁺) и дальнейшей утрате экспрессии молекул CCR7 в клетках эффекторной памяти (CD45RA^–CD45R0⁺CCR7^–). Часть CCR7-негативных лимфоцитов восстанавливает экспрессию молекул CD45RA и относится к пулу терминально-дифференцированных клеток (CD45RA⁺CD45R0^–CCR7^–). Каждая из субпопуляций CD4⁺ Т-лимфоцитов выполняет различные функции и обладает уникальными метаболическими свойствами [10].

Митохондрии являются жизненно важными органеллами CD4⁺ Т-лимфоцитов, которые связаны с метаболизмом, продукцией энергии, клеточным дыханием, пролифераций, дифференцировкой и апоптозом [2]. Адаптация митохондрий к потребностям клетки реализуется через модификацию формы и размера органелл [2, 4], что сопровождается изменением их массы и числа в клетке. Еще одним важным показателем функционального состояния митохондрий является заряд их мембраны. Митохондриальный мембранный потенциал возникает в результате окислительно-восстановительных реакций, связанных с активностью цикла Кребса, и служит промежуточной формой хранения энергии, которая в дальнейшем используется для синтеза аденозинтрифосфата (АТФ) [2]. Ранее мы показали, что у здоровых субъектов масса и заряд митохондрий CD4⁺ Т-лимфоцитов, позитивных и негативных по экспрессии молекул CD45RA, существенно различается [1].

Целью настоящей работы была оценка состояния митохондрий в различных субпопуляциях CD4⁺ Т-лимфоцитов.

Материалы и методы

Объектом исследования были мононуклеарные клетки, полученные из периферической крови относительно здоровых добровольцев (n=9). Каждый обследованный подписал согласие на участие в исследовании, проведение которого было одобрено этическим комитетом (рег. №IRB00008964). Забор крови проводили в вакуумные пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (Weihai Hongyu Medical Devices Co Ltd, Китай). Мононуклеарные клетки выделяли путем центрифугирования двукратно разведенной крови (раствор фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS), Gibco, США) в градиенте плотности Диаколла (1,077, Диаэм, Россия). Выделенные клетки после двукратного отмывания в растворе DPBS помещали в термоинактивированную эмбриональную телячью сыворотку (Biowest, Колумбия), содержащую 10% диметилсульфоксида (AppliChem, Германия), и подвергали контролируемому замораживанию в жидком азоте. Перед проведением исследования клетки размораживали.

Идентификацию жизнеспособных субпопуляций Т-лимфоцитов проводили на проточном цитофлуориметре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных анти-CD3-BV605, анти-CD4-PE, анти-CCR7-PE/Cy7 (BioLegend, США), анти-CD45R0-APC-eFluor™780 антител (Thermo Fisher Scientific, США) и витального красителя Zombie UV Fixable Viability Kit (BioLegend, США). Среди CD4⁺ Т-лимфоцитов выявляли наивные клетки (CD45R0^–CCR7⁺), клетки центральной (CD45R0⁺CCR7⁺) и эффекторной (CD45R0⁺CCR7^–) памяти, а также терминально-дифференцированные эффекторы (CD45R0^–CCR7^–). Митохондриально-селективные флуоресцентные красители MitoTracker Green FM и MitoTracker™ Deep Red FM (Invitrogen, США) были применены, соответственно, для оценки массы и мембранного потенциала митохондрий в CD4⁺ Т-лимфоцитах. Реагенты готовили согласно прилагаемым инструкциям, конечные концентрации MitoTracker Green FM (MTG) и MitoTracker Deep Red FM (MTDR) составили 100 нМ и 75 нМ соответственно. Блокирование АТФ-связывающих кассетных транспортеров (ATP-binding cassette (ABC) transporters) для предотвращения экспорта митохондриальных красителей [7] осуществляли добавлением верапамила (Sigma, США) в конечной концентрации 40 мкМ.

Статистический анализ выполняли с помощью непараметрических методов. В выборке рассчитывали медиану и интерквартильный размах (25-75 персентиль). Достоверность различий определяли с помощью критерия Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

Средний возраст обследованных здоровых субъектов составил 40 лет (32,5–43,5 лет), на долю мужчин приходилось 56%. Различий по всем исследованным параметрам между женщинами и мужчинами не выявлено. Относительное количество CD4⁺ Т-лимфоцитов крови составило 36,7 % (34,4–46,8 %), что соответствует норме (32746780). Субпопуляционный состав CD4⁺ Т-клеток был представлен следующим образом. Наиболее многочисленными были наивные лимфоциты, на долю которых приходилось 57,0 % (31,7–60,5 %) общего пула. Клетки центральной памяти составили почти треть всего пула CD4⁺ Т-лимфоцитов: 30,9 % (25,2–43,9 %). Относительное число клеток эффекторной памяти и терминально-дифференцированных эффекторов составило 14,6 % (11,1–21,8 %) и 0,7 % (0,4–1,6 %) соответственно. Установленные в настоящей работе показатели распределения CD4⁺ Т-лимфоцитов периферической крови здоровых лиц по субпопуляциям соответствуют ранее представленным данным [13].

Для оценки массы митохондрий в CD4⁺ Т-лимфоцитах был применен флуоресцентный краситель MTG. Данный реагент спонтанно проникает в клетку и предпочтительно аккумулируется в митохондриях, взаимодействуя с остатками цистеина в составе белков матрикса [5]. При этом интенсивность его свечения прямо пропорциональна массе органелл и не зависит от их поляризационного статуса [5]. Цитофлуориметрический анализ выявил отличия в способности накопления красителя MTG разными субпопуляциями CD4⁺ Т-клеток (рисунок 1).

Рисунок 1. Оценка массы митохондрий в различных субпопуляциях CD4⁺ Т-лимфоцитов с использованием красителя MitoTracker Green

Примечание. CD4⁺ T cells – общий пул CD4⁺ Т-лимфоцитов; субпопуляции клеток: T_N – наивные, T_CM – центральной памяти, T_EM – эффекторной памяти, T_EMRA – терминально-дифференцированные. По оси ординат указана медиана яркости флуоресценции (MFI) клеток, содержащих краситель в матриксе митохондрий. Представлены медианы (горизонтальные линии), межквартильные интервалы (прямоугольники) и 10-90% размахи (вертикальные отрезки). ** – P<0,01; *** – P<0,001 (критерий Манна-Уитни).

Figure 1. Assessment of mitochondrial mass in CD4⁺ T cells using the MitoTracker Green dye

Note. CD4⁺ T cells – total pool of CD4⁺ T lymphocytes; cells subsets: T_N – naive, T_CM – central memory, T_EM – effector memory, T_EMRA – terminally differentiated (effector memory T cells re-expressing CD45RA). The y-axis shows the median fluorescence intensity (MFI: Median Fluorescence Intensity) of MitoTracker Green in cells containing the dye in the mitochondrial matrix. Medians (horizontal lines within boxes), interquartile ranges (boxes), and 10–90% ranges (vertical bars) are shown. ** – P<0.01; *** – P<0.001 (Mann-Whitney U-test).

 

Наивные лимфоциты по сравнению с субпопуляциями клеток памяти и терминально-дифференцированных эффекторов обладали сниженной массой митохондрий (P<0,001). Ранее рядом авторов было установлено, что CD4⁺ Т-клетки эффекторной памяти содержат митохондрии элонгированной/разветвленной формы [8] и, в отличие от наивных лимфоцитов, демонстрируют более высокую интенсивность свечения при окраске MTG [7]. Повышенная масса митохондрий Т-клеток памяти обеспечивает их биоэнергетическое преимущество при повторном контакте с антигеном, что позволяет рассматривать клетки памяти как метаболически более адаптированную субпопуляцию лимфоцитов [10].

Проведенный нами анализ интенсивности флуоресценции MTG в пуле CD45R0⁺ элементов показал, что по сравнению с клетками центральной памяти лимфоциты эффекторной памяти обладали более высокой массой митохондрий (P<0,001). Две субпопуляции клеток памяти отличаются экспрессией хемокинового рецептора CCR7, определяющего пути миграции лимфоцитов. Циркулирующие в крови CCR7⁺ лимфоциты центральной памяти способны входить в лимфатические узлы, тогда как CCR7-негативные клетки эффекторной памяти экспрессируют рецепторы для миграции в периферические ткани, где по сравнению с кровотоком содержание кислорода значительно ниже [3]. По-видимому, метаболическая адаптация клеток эффекторной памяти к различным условиям микроокружения (циркуляция между богатой кислородом кровью и тканями с его дефицитом) обеспечивается, в том числе, и за счет повышенной массы митохондрий. Так, было показано, что в экспериментально созданных условиях гипоксии выживаемость наивных CD4⁺ Т-лимфоцитов была снижена по сравнению с клетками эффекторной памяти, при этом последние продуцировали больше АТФ и обладали лучшей миграционной способностью [8].

Ряд авторов указывает на более высокую массу митохондрий в терминальных эффекторах по сравнению с менее дифференцированными субпопуляциями Т-лимфоцитов [4]. Проведенная нами оценка интенсивности флуоресценции красителя MTG показала, что масса митохондрий в терминально-дифференцированных CD4⁺ Т-лимфоцитах не отличалась от таковой в клетках эффекторной памяти, но была выше, чем в лимфоцитах центральной памяти (P<0,01) и наивных элементах (P<0,001).

В целом, полученные данные указывают на то, что наивные CD4⁺ Т-лимфоциты здоровых добровольцев обладают сниженной массой митохондрий, чем более дифференцированные субпопуляции. При этом масса органелл в функционально различных субпопуляциях клеток памяти существенно отличается: повышена в лимфоцитах эффекторной памяти относительно таковой в клетках центральной памяти. Более зрелые субпопуляции CD4⁺ Т-лимфоцитов – клетки эффекторной памяти и терминально-дифференцированные эффекторы – не различаются по показателям массы митохондрий, но демонстрируют повышенную массу органелл по сравнению с наивными элементами и клетками центральной памяти.

С целью оценки другого показателя функционального состояния митохондрий – мембранного потенциала – нами был использован флуоресцентный краситель MTDR. Данный реагент относится к группе липофильных катионных красителей, которые свободно диффундируют в клетку и под действием потенциала на внутренней мембране митохондрий накапливаются в водном пространстве матрикса [12]. Ранее было установлено, что деполяризация митохондрий, индуцированная внесением карбонилцианид 3-хлорфенилгидразона (carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)), сопровождается снижением интенсивности свечения MTDR в клетках [15], что позволяет использовать его как потенциал-чувствительный реагент. При исследовании нами показателей флуоресценции MTDR в различных субпопуляциях CD4⁺ Т-лимфоцитов было выявлено следующее (рисунок 2).

Рисунок 2. Исследование мембранного потенциала митохондрий в различных субпопуляциях CD4⁺ Т-лимфоцитов с использованием красителя MitoTracker Deep Red

Примечание. CD4⁺ T cells – общий пул CD4⁺ Т-лимфоцитов; субпопуляции клеток: T_N – наивные, T_CM – центральной памяти, T_EM – эффекторной памяти, T_EMRA – терминально-дифференцированные. По оси ординат указана медиана яркости флуоресценции (MFI) красителя в клетках с функционально активными митохондриями. Представлены медианы (горизонтальные линии), межквартильные интервалы (прямоугольники) и 10-90% размахи (вертикальные отрезки). * – P<0,05; ** – P<0,01 (критерий Манна-Уитни).

Figure 2. Assessment of mitochondrial membrane potential in CD4+ T cells using the MitoTracker Deep Red dye

Note. CD4⁺ T cells – total pool of CD4⁺ T lymphocytes; cells subsets: T_N – naive, T_CM – central memory, T_EM – effector memory, T_EMRA – terminally differentiated (effector memory T cells re-expressing CD45RA). The y-axis shows the median fluorescence intensity (MFI: Median Fluorescence Intensity) of MitoTracker Deep Red in cells with functionally active mitochondria. Medians (horizontal lines within boxes), interquartile ranges (boxes), and 10–90% ranges (vertical bars) are shown. * – P<0.05; ** – P<0.01 (Mann-Whitney U-test).   

 

Клетки с фенотипом памяти (CD45R0⁺) демонстрировали более высокую интенсивность свечения по сравнению с CD45R0-негативными субпопуляциями – наивными лимфоцитами (P<0,01) и терминально-дифференцированными эффекторами (P<0,05). Оценка мембранного потенциала митохондрий в CD45R0⁺ субпопуляциях не выявила статистически значимых отличий между показателями в клетках центральной и эффекторной памяти. Хотя средняя интенсивность свечения красителя в терминально-дифференцированных элементах была выше, чем в наивных лимфоцитах, статистически значимых различий заряда мембраны митохондрий между обеими субпопуляциями не установлено (P>0,05).

На основании полученных данных можно заключить, что у здоровых субъектов CD4⁺ Т-лимфоциты центральной и эффекторной памяти по сравнению с наивными клетками обладают более высокой массой и величиной мембранного потенциала митохондрий. Необходимо отметить, что при использовании нами ранее потенциал-чувствительного красителя MitoTracker Orange и изоформы общего лейкоцитарного антигена СD45RA были получены аналогичные данные: у здоровых добровольцев масса и заряд мембраны митохондрий в CD4⁺ Т-лимфоцитах памяти (СD45RA^–) были выше, чем в СD45RA⁺ клетках [1]. Известно, что оба пула клеток неоднородны и включают лимфоциты с разными функциональными свойствами и метаболической активностью [10]. Выявленная нами более высокая масса митохондрий в CD4⁺ Т-лимфоцитах эффекторной памяти может быть связана как с необходимостью адаптации к гипоксическим условиям периферических тканей, так и с готовностью органелл обеспечивать клетку энергией и молекулами для быстрого синтеза эффекторных цитокинов в ответ на антиген.

Ранее рядом авторов было установлено, что величина мембранного потенциала митохондрий является ключевым фактором формирования CD8⁺ Т-лимфоцитов памяти [14]. Полученные нами данные подтверждают это и для CD4⁺ Т-клеток: лимфоциты центральной и эффекторной памяти демонстрируют более высокий заряд мембраны митохондрий, чем наивные и терминально-дифференцированные элементы. Что касается пула CD45R0-негативных клеток, то наиболее интересные, на наш взгляд, данные были получены при оценке состояния митохондрий в терминально-дифференцированных эффекторах. Эти клетки рассматривают в качестве самых зрелых форм лимфоцитов [6]. Как и менее дифференцированная субпопуляция клеток эффекторной памяти терминально-дифференцированные лимфоциты демонстрируют схожую массу митохондрий. При этом величина мембранного потенциала митохондрий в терминально-дифференцированных эффекторах была существенно снижена по сравнению с таковыми показателями в обеих субпопуляциях клеток памяти. Исходя из этого, можно заключить, что терминально-дифференцированные эффекторы отличаются от остальных субпопуляций CD4⁺ Т-лимфоцитов уникальными характеристиками митохондрий: при высокой массе обладают сниженным зарядом мембраны. Известно, что клетки, находящиеся на терминальной стадии дифференцировки, демонстрируют признаки старения, ослабление пролиферативной активности, высокие уровни повреждения ДНК, потерю активности теломеразы, понижение экспрессии антиапоптотических белков семейства Bcl-2 [6]. Мембранный потенциал митохондрий является важным показателем функционального состояния митохондрий, а его утрата ассоциирована с митохондриальным путем апоптоза [9]. Полученные в настоящем исследовании данные о состоянии митохондрий терминально-дифференцированных эффекторов также свидетельствуют о «готовности» клеток к программируемой гибели.

Необходимо также отметить, что исследование показателей состояния митохондрий с помощью флуоресцентных красителей без внесения в схему эксперимента ингибиторов АТФ-связывающих кассетных транспортеров (ATP-binding cassette (ABC) transporters) может влиять на оценку результатов цитофлуориметрического анализа. АВС-транспортеры расположены на мембранах клетки и способны выводить из нее различные субстраты. Как правило, большинство исследователей не принимает во внимание наличие данных белков-транспортеров, тогда как их активность представляет реальную проблему при оценке параметров митохондрий с использованием флуоресцентных реагентов. Так, группой авторов была показана способность АВС-транспортеров выкачивать MitoTracker Green из CD4⁺ Т-лимфоцитов, при этом блокирование транспортеров рядом ингибиторов приводило к росту интенсивности флуоресценции красителя [7]. На наш взгляд эти данные свидетельствуют о важности стандартизации условий эксперимента при использовании митохондриально-селективных флуоресцентных реагентов. Кроме того, нарушение функционирования АВС-транспортеров может влиять на интерпретацию результатов оценки состояния митохондрий при исследовании их параметров в различных клинических группах.

Заключение

Таким образом, установлено, что у здоровых субъектов CD4⁺ Т-лимфоциты центральной и эффекторной памяти по сравнению с наивными клетками обладают более высокой массой и величиной мембранного потенциала митохондрий. Масса органелл в функционально различных субпопуляциях клеток памяти существенно отличается: повышена в лимфоцитах эффекторной памяти относительно таковой в клетках центральной памяти. Терминально-дифференцированные эффекторы отличаются от остальных субпопуляций CD4⁺ Т-лимфоцитов уникальными характеристиками митохондрий: при высокой массе обладают сниженным зарядом мембраны. Данная особенность может быть связана с «готовностью» клеток, находящихся на терминальной стадии дифференцировки, к программируемой гибели.

Работа выполнена в рамках государственного задания «Изучение механизмов регуляции клеток иммунной системы и разработка методов их оценки в норме и патологии» (номер гос. регистрации 124020500027-7).

Благодарности

В работе было использовано оборудование ЦКП “Исследования материалов и вещества” ПФИЦ УрО РАН.

About the authors

Larisa Korolevskaya

Institute of Ecology and Genetic of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences, Branch of Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences (IEGM UB RAS)

Email: bioqueen@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9840-7578

PhD, Research Scientist, Laboratory of Ecological Immunology

Russian Federation

Konstantin V. Shmagel

Institute of Ecology and Genetic of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences, Branch of Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences (IEGM UB RAS)

Author for correspondence.
Email: k.shmagel@gmail.com

Dr. Sc. (Med.), Head of the Laboratory of Ecological Immunology

References

Supplementary files