Inhibition of TLR4 and NLRP3 leads to the exacerbation of IgE specific antibodies in mouse allergic models based on subcutaneous or intranasal immunization respectively

Full Text

Введение

Стремительный рост частоты встречаемости патологий, связанных с продукцией IgE на безвредные антигены, является одним из вызовов, стоящих перед современной медициной [2]. Одной из главных гипотез, объясняющих рост встречаемости патологий данного рода, является так называемая «гигиеническая гипотеза». Согласно данной гипотезе при уменьшении частоты встреч организма с бактериальными и вирусными патогенами, при уменьшении разнообразия антигенов, с которым организм сталкивается в течение жизни, в том числе антигенов, активирующих PRR-рецепторы, происходит смещение равновесия иммунологических реакций в сторону 2-го типа иммунного ответа [14]. Таким образом, организм начинает «неправильно» реагировать на безвредные антигены, чем-то отдаленно похожие на антигены потенциально опасных патогенов. Вместо ответа на потенциально опасные патогены по механизму 1-го типа иммунного ответа, запускаются реакции на безвредные белки преимущественно по механизму 2-го типа иммунного ответа [15]. Интересно, что некоторые белковые аллергены, несмотря на то, что не содержат в своем составе классических агонистов TLR, способны их активировать. В качестве примера можно привести аллерген клещей домашней пыли Der f2, способный активировать TLR4 [12]. В классическом модельном аллергене овальбумине (OVA) примести, являющиеся классическими агонистами TLR (LPS) и активирующие TLR4 [13].

В то же время роль активации TLR в патогенезе продукции аллерген-специфических антител и локального аллергического воспаления не однозначна. Достаточно большое количество работ указывает на то, что активация TLR, в частности TLR4, служит одним из триггеров локального аллергического воспаления [1]. В то же время существуют работы, согласно которым блокирование TLR4 ухудшает общую клиническую картину воспаления (в частности, усиливает локальное накопление эозинофилов в ткани легких) [9].

Еще одним PRR, с которым часто связывают формирование локального аллергического воспаления, является NLRP3 инфламмасома. Роль этого внутриклеточного PRR в формировании аллергического воспаления показана во многих работах [3]. Обыкновенно к активации NLRP3 приводят изменение концентрации внутриклеточных ионов K⁺, Cl^-, Ca²⁺; активные формы кислорода (АФК); дестабилизация мембран лизосом с выходом содержимого в цитоплазму, например, под действием кристаллов мочевой кислоты, холестерола, фосфата кальция, частиц асбеста или кремнезема [3, 4]. В то же время существует и другая точка зрения, согласно которой NLRP3-инфламмасома не влияет на формирование аллергического воспаления, по крайней мере адаптивного аллергического иммунного ответа [8].

Целью настоящей работы было показать роль TLR4-рецептора и NLRP3-инфламмасомы в формировании продукции аллерген-специфических антител в двух моделях аллергии с использованием специфических низкомолекулярных ингибиторов этих рецепторов – TLR4-IN-C34 и CY-09 соответственно. В первой модели аллергического гуморального ответа животным вводили модельный аллерген OVA интраназально с аэрополлютантом бензо(а)пиреном (BaP). Во второй модели использовали подкожную иммунизацию в область холки без дополнительных стимулов, как описано нами в работе [7].

Материалы и методы

Иммунизация и забор образцов

Мыши линии BALB/c, самки, в возрасте 6-7 недель были приобретены в Научном центре биомедицинских технологий (Андреевка, Россия). Животные содержались в клетках с использованием опилок в качестве подстилки и доступом к воде и корму ad libitum при 12-часовом цикле свет-темнота. Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных (IACUC) Института биоорганической химии имени Шемякина и Овчинникова РАН (протокол № 147/2021).

В качестве модельного антигена использовался коммерческий белок овальбумин (OVA) (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия), содержащий в своем составе не более 0,04 EU LPS на 10 мкг белка по результатам LAL-теста.

В работе использовались две модели аллергии. В первой модели животные были иммунизированы подкожно в область холки. Модельный антиген овальбумин (OVA) вводился в дозе 0,1 мкг в физиологическом растворе объемом 0,1 мл. Введение осуществлялось 3 раза в неделю первые 2 недели и по 2 раза в неделю в последующие. Во второй модели иммунизация проводилась интраназально. OVA вводился в дозе 0,3 мкг в физиологическом растворе в объеме 50 мкл. Введение осуществлялось 2 раза в неделю в течение 8 недель. Вместе с OVA части животным вводился аэрополлютант BaP в дозе 4 нг. Для оценки роли активации TLR4 и NLRP3 в формировании гуморального ответа на вводимый аллерген части животным опытных групп вводили ингибиторы этих рецепторов – TLR4-IN-C34 [6] в дозе 1 мг/ кг и CY-09 [15] в дозе 20 мг/кг соответственно. В качестве отрицательного контроля служили интактные животные, а также животные, иммунизированные носителем (физиологическим раствором).

Забор крови для оценки уровня продукции специфических антител проводился из подглазничного синуса. Образцы крови инкубировали при +37 °С 20 минут до образования тромба, который затем отделялся от сыворотки центрифугированием при 600 g. Сыворотки хранили при -20 °С до момента использования.

Постановка иммуноферментного анализа (ИФА)

В лунки 96-луночного планшета (Costar, MaxiSorb) наносили 50 мкл раствора OVA в PBS pH = 7,2 и оставляли инкубироваться на 18 часов при +4 °С. При постановке ИФА на определение специфического IgE использовали раствор с концентрацией белка 20 мкг/мл, а при постановке на специфический IgG1 – 5 мкг/мл. Между стадиями проводили трехкратную отмывку раствором Твин-20 0,05% в PBS Блокирование осуществляли раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) объемом 100 мкл в PBS концентрации 5% при определении специфического IgE, или 1% при определении специфического IgG1. Инкубацию с блокирующим буфером осуществляли в течение часа. Затем в лунки наносились сыворотки в различном разведении в соответствующем блокирующем буфере. Инкубацию с сыворотками осуществляли на ночь при +4 °С. Далее наносились коммерческие конъюгаты антител. При определении специфических IgE использовали анти-мышиные IgE, меченые пероксидазой хрена (ПХ) (клон 23G3, Abcam, Великобритания) в разведеиии 1:2000 и инкубировали в течение 3 часов. Для определения специфического IgG1 использовали меченые биотином антитела (клон RMG1-1, BioLegend, США) в разведении 1:5000. В качестве вторичного конъюгата в последнем случае добавляли на завершающей стадии конъюгат ПХ со стрептавидином (BioLegend, США) в разведении 1:7000. Проявление реакции осуществляли с использованием субстрата на основе 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) в присутствии 4 мМ перекиси водорода. Оптическая плотность измерялась с помощью автоматического спектрофотометра (Thermo Fisher Scientific, США), на длине волны 450 нм за вычетом оптической плотности при 620 нм как фоновой. За титр сыворотки принималось наибольшее ее разведение, при котором оптическая плотность согласно титровочной кривой превышала фоновую на 3 стандартных отклонения последней.

Статистика

Все результаты представлены в виде средних значений и соответствующих величин стандартного отклонения. Статистическую значимость различий между группами определяли с использованием теста ANOVA с поправкой на множественное сравнение по методу Sidak. Значения p по данному тесту, эквивалентные p < 0,05 с поправкой на множественное сравнение, считали статистически достоверными.

Результаты и обсуждение

Для того чтобы выяснить роль TLR4 и NLRP3 PRR-рецепторов в формировании аллергенспецифического гуморального ответа, в данной работе использовали низкомолекулярные фармакологические ингибиторы. Для изучения роли TLR4 использовали ингибитор TLR4-IN-C34 [6], а для изучения роли NLRP3 – ингибитор CY- 09 [15].

Введение антигена животным в модели подкожной иммунизации в область холки достоверно стимулировала у последних продукцию специфических антител классов IgE и IgG1, как было показано нами ранее [7] (рис. 1). Дополнительное введение вместе с антигеном ингибитора TLR4-IN-C34 достоверно (p < 0,01) и существенно усиливало продукцию OVA специфического IgE. Продукция специфического IgE повысилась примерно в 2,5 раза (значения титров в группе без ингибитора и с ингибитором, соответственно, 2950±180 и 8000±1000) (рис. 1А). В то же время достоверного влияния на продукцию специфического IgG1 обнаружено не было (титры соответственно 1,23±0,14 × 10⁶ и 1,9±0,4 × 10⁶) (рис. 1Б). Ингибитор инфламмасомы CY-09 не оказывал достоверного влияния на продукцию аллерген-специфических антител в данной модели (рис. 1).

 

Рисунок 1. Влияние ингибиторов TLR4 и NLRP3 на гуморальный ответ в модели аллергии с подкожной иммунизацией

Примечание. Продукция специфических антител класса IgE (A) и IgG1 (Б) у мышей линии BALB/c после 6 недель иммунизации физиологическим раствором (Veh, «носитель») без антигена, OVA в дозе 0,1 мкг без ингибиторов, а также с ингибитором TLR4 рецептора TLR4-IN-C34 в дозе 1 мг/кг или с ингибитором NLRP3 рецептора CY-09 в дозе 20 мг/кг. */**/*** – p < 0,05/0,01/0,001 при сравнении с животными, которым вводили только физиологический раствор; #/## – p < 0,05/0,01 при сравнении с животными, иммунизированными антигеном без ингибитора.

Figure 1. Effect of TLR4 and NLRP3 inhibitors on humoral response in a subcutaneous allergy model

Note. Production of specific antibodies of the IgE (A) and IgG1 (B) classes in BALB/c mice after 6 weeks of immunization with saline solution (Veh, “vehicle”) without antigen, with OVA at a dose of 0.1 µg without inhibitors, and also in the presence of TLR4 receptor inhibitor TLR4-IN-C34 at a dose of 1 mg/kg or with the NLRP3 receptor inhibitor CY-09 at a dose of 20 mg/kg. */**/***, p < 0.05/0.01/0.001 significance of the difference when compared with saline immunized mice; #/##, p < 0.05/0. significance of the difference when compared with mice immunized by OVA without inhibitors.

 

Известно, что частицы, являющиеся продуктами неполного сгорания дизельного топлива, индуцируют формирование локального воспаления при попадании в легкие [5]. В данной работе был использован основной действующий компонент подобных частиц – бензо(а)пирен (BaP). В модели аллергии с использованием интраназального протокола достоверная в сравнении с группой, иммунизированной физраствором, продукция аллерген-специфических антител возникала только в группах, которым вводили BaP. Аэрополлютант достоверно повышал продукцию специфического IgE (p < 0,05). Также под действием BaP повышалась продукция аллерген-специфических IgG1 (p < 0,01) (рис. 2). Продукция специфического IgE под действием BaP возрастала более чем в 2 раза (титры в группе с антигеном без BaP и с BaP соответственно 80±30 и 200±40 соответственно), а продукция специфического IgG1 более чем в 10 раз (титры 0,10±0,04 × 10⁶ и 1,2±0,3 × 10⁶ соответственно) (рис. 2).

 

Рисунок 2. Влияние ингибиторов TLR4 и NLRP3 на гуморальный ответ в модели аллергии с интраназальной иммунизацией

Примечание. Продукция специфических антител класса IgE (A) и IgG1 (Б) у мышей линии BALB/c после 8 недель иммунизации антигеном OVA в дозе 0,3 мкг без дополнительных стимулов и ингибиторов, OVA в присутствии BaP в дозе 4 нг, а также OVA и BaP с ингибитором TLR4-рецептора TLR4-IN-C34 в дозе 1 мг/кг или с ингибитором NLRP3-рецептора CY-09 в дозе 20 мг/кг. */**/*** – p < 0,05/0,01/0,001 при сравнении с животными, которым вводили только физиологический раствор; §/§§ – p < 0,05/0,01 при сравнении животных, иммунизированных антигеном с BaP и без него; #/## – p < 0,05/0,01 при сравнении с животными, иммунизированными антигеном без ингибитора.

Figure 2. Effect of TLR4 and NLRP3 inhibitors on the humoral response in the allergy model with intranasal immunization

Note. Production of specific antibodies of the IgE (A) and IgG1 (B) classes in BALB/c mice after 8 weeks of immunization with the OVA antigen at a dose of 0.3 µg without additional stimuli and inhibitors, with OVA in the presence of BaP at a dose of 4 ng, and OVA and BaP with the TLR4 receptor inhibitor TLR4-IN-C34 at a dose of 1 mg/kg or with the NLRP3 receptor inhibitor CY-09 at a dose of 20 mg/kg. */**/***, p < 0.05/0.01/0.001 significance of the difference when compared with saline immunized mice; §/§§, p < 0.05/0.01 significance of difference when compared the groups immunized by antigen with and without BaP; #/##, p < 0.05/0.01 significance of the difference when compared with mice immunized by OVA without inhibitors.

 

В данной модели ингибитор TLR4-IN-C34 не оказывал достоверного влияния на продукцию аллерген-специфических антител. Напротив, ингибитор NLRP3 инфламмасомы CY-09 достоверно (p < 0,05) повышал продукцию аллерген-специфических антител класса IgE. Повышение было довольно значительным, почти в 3 раза, титры в группе без ингибитора и с ингибитором соответственно 200±40 и 500±20 (рис. 2А). В то же время достоверного влияния на продукцию специфического IgG1 этот компонент не оказывал (титры в группе без ингибитора и с ингибитором соответственно 1,2±0,3 × 10⁶ и 1,1±0,4 × 10⁶ соответственно).

Таким образом, роль активации TLR4 присутствует в модели с использованием подкожной иммунизации, а роль NLRP3 инфламмасомы в модели с использованием интраназальной иммунизации и аэрополюютанта.

Роль TLR4 в формировании локального аллергического воспаления и продукции аллерген-специфических антител показана во многих работах, например [1], другое дело что данная роль неоднозначна. Однако существуют работы, где показана и его ингибирующая роль в развитии патологического процесса [9]. Эффект сильно зависит от количества агониста TLR4 LPS, содержащейся как примесь в белковых аллергенах. В настоящей работе нами показано, что активация TLR4 в процессе аллергического воспаления, блокировавшаяся низкомолекулярным ингибитором TLR4-IN-C34, подавляла продукцию специфического IgE в модели с подкожной иммунизацией. Ингибитор достоверно и примерно в 2 раза усиливал продукцию белок-специфического IgE, но не IgG1 в данной модели, но не в модели с интраназальным введением аллергена. Используемый нами OVA содержал минимальные примести LPS (0,04 EU в 10 мкг белка), что, возможно, было достаточно для слабой активации TLR4. Однако активировать TLR4 способен не только LPS, но также некоторые белковые алармины, высвобождающиеся из повреждаемых клеток, такие как HMGB1 [10]. Скорее всего, эффект был обусловлен именно ими.

Напротив, роль активации NLRP3-инфламмасомы присутствовала в модели с использованием интраназальной иммунизации. В этом случае эффект ингибитора CY-09 также носил стимулирующий характер и проявлялся только в отношении продукции специфического IgE (подъем продукции в 2,5 раза), но не IgG1. Это, казалось бы, противоречит литературным данным, показавшим необходимость активации NLRP3-инфламмасомы для развития аллергического воспаления [3]. Возможное объяснение заключается в том, что в некоторых условиях активация NLRP3-инфламмасомы может вызвать особый вид клеточной смерти – пироптоз, связанный с формированием больших пор в цитоплазматической мембране с участием гасдермина D [4]. При этом пироптоз может наблюдаться не только в макрофагах, но и в В-лимфоцитах [11]. В-лимфоцитах он возможен при действии на них высоких доз фактора BAFF при условии отсутствия параллельной стимуляции В-клеточного рецептора антигеном, процесс зависит от формирования АФК и выхода ионов K⁺ из клеток [11]. В том случае, если предшественники IgE⁺В-лимфоцитов и плазматических клеток, либо сами эти клетки, подвергались подобному процессу, ингибирование NLRP3-инфламмасомы могло способствовать их выживаемости.

Важно отметить, что в обоих случаях эффект низкомолекулярных ингибиторов проявлялся именно в отношении продукции специфических IgE. Таким образом, разработка и использование мягких агонистов TLR4 и NLRP3 представляется нам перспективной для использования в методе аллерген-специфической иммунотерапии.

Заключение

Таким образом, ингибитор TLR4 и NLRP3 повышали продукцию специфического IgE соответственно в модели с использованием подкожной иммунизации и в модели с использованием интраназальной иммунизации соответственно. Достоверного влияния на продукцию специфических IgG1 не было.

About the authors

D. B. Chudakov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: boris-chudakov@yandex.ru

PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Cell Interactions

Russian Federation, Moscow

O. A. Shustova

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: boris-chudakov@yandex.ru

PhD (Biology), Junior Research Associate, Laboratory of Cell Interactions

Russian Federation, Moscow

M. V. Konovalova

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: boris-chudakov@yandex.ru

PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Cell Interactions

Russian Federation, Moscow

R. A. Velichinskii

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: boris-chudakov@yandex.ru

Research Engineer, Laboratory of Cell Interactions

Russian Federation, Moscow

G. V. Fattakhova

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: boris-chudakov@yandex.ru

PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Cell Interactions

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files