Genetic modification of primary human B cells to model the process of B cell development in germinal centers

Full Text

Введение

При первичном В-клеточном ответе происходит активация наивных антиген-специфических В-клеток и их дифференцировка в одну из следующих популяций: плазмабласты, клетки памяти и плазматические клетки [6]. Этот важный этап в развитии В-лимфоцитов проходит в герминативных центрах лимфоузлов. Дифференцировка В-клеток сопровождается переключением синтеза Ig и созреванием аффинности антител [5]. Для изучения процессов дифференцировки в зародышевых центрах применяют несколько модельных систем, в частности используются генетически модифицированные мыши. Очевидно, что этот подход имеет серьезные ограничения; связанные, главным образом, с тем, что мыши не всегда точно отражают иммунологические процессы, проходящие у человека. Привлекательным решением является создание системы, которая позволит ex vivo моделировать процессы, происходящие в зародышевых центрах. В светлой зоне зародышевых центров присутствуют клетки, которые одновременно экспрессируют BCR и секретируют антитела [7]. Для создания модельной системы эти клетки наиболее интересны, поскольку они представляют популяцию пре-плазмабластов, готовых к переходу как в В-клетки памяти, так и в плазматические клетки.

Важную роль в созревании В-лимфоцитов играют фолликулярные Т-хелперы (Tfh), которые несут на своей поверхности молекулу CD40L, взаимодействие которой с рецептором CD40 на В-лимфоците приводит к запуску NF-êB пути активации. В дополнении к этому Tfh стимулируют созревание B-клеток с помощью секретируемых цитокинов, среди которых наиболее мощным драйвером дифференцировки В-клеток является IL-21, который инициирует STAT3 путь активации [4]. Совместное действие IL-21 и CD40L является минимальной комбинацией сигналов, которая обеспечивает надежную активацию В-лимфоцитов. Однако эта система имеет существенный недостаток: активированные клетки быстро достигают терминальной дифференцировки, которая сопровождается остановкой клеточного цикла. Решить эту проблему возможно с помощью трансгенеза. В настоящей работе получены генетически модифицированные В-клетки крови человека, которые в течении двух месяцев поддерживались в состоянии преплазмабластов.

Материалы и методы

Плазмиды MSCV-Bcl6 (#31391) и pMIG-Bcl-xL (#3541), кодирующие белки Bcl-6 и Bcl-XL, были получены из Addgene (США). Используя эти плазмиды, была получена кассета, которая состояла из генов BCL6 и BCLXL, разделенных последовательностью саморазрезаемого пептида P2A. В качестве репортерного гена использовали GFP, который был отделен от целевых генов последовательностью IRES. Кассету клонировали в лентивирусный вектор pUCHR (#110661, Addgene, США).

Для получения лентивирусных частиц клетки НЕК293 временно трансфицировали тремя плазмидами: трансферной pUCHR-Bcl6-Bcl-XL-IRES-GFP, упаковочной Δ8.2R и плазмидой, кодирующей поверхностный гликопротеин вируса везикулярного стоматита VSV-G (#14888, AddGene, США). Через 4 дня после трансфекции лентивирусные частицы собирали из культуральных супернатантов и концентрировали методом ультрацентрифугирования.

Образцы цельной крови собирали в гепаринизированные вакутейнерные пробирки (Sarstedt, Германия). Мононуклеарные клетки крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (ñ = 1,077 г/см³). B-лимфоциты обогащали методом отрицательной иммуномагнитной сепарации с использованием набора Dynabeads Untouched human B cell kit (Thermo Fisher Scientific, США).

В качестве источника CD40L использовали фидерные клетки A549, которые были стабильно трансфицированы геном, кодирующим CD40L [1]. Фидерные клетки, обработанные 10 мкг/мл митомицином-С (Киова Хакко Когио, Япония), а также выделенные В-лимфоциты высевали по 10 000 клеток на лунку в 96-луночный планшет. В-лимфоциты культивировали в среде DMEM с добавлением 10%-ной фетальной бычьей сыворотки, 24 мкг/мл гентамицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES (НПП «ПанЭко», Россия) и 25 нг/мл IL-21 (ООО «СайСторЛаб», Россия) при 37 °C в 5% CO₂.

Для окрашивания лимфоцитов использовали моноклональные антитела: CD19-PE (клон LT19), CD27-PECy5.5 (клон LT27), CD38-PECy7 (клон LT38), против IgG (клон CH1) и IgM (клон CH2) человека, которые ранее были получены в нашей лаборатории [1]. Использовали также моноклональные антитела против Bcl-6 (клон 7D1, BioLegend, США) и Bcl-XL (поликлон sc-634, Santa Cruz, США). Флуоресценцию клеток регистрировали с помощью проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США).

Результаты и обсуждение

B-лимфоциты, выделенные из крови, стимулировали с помощью рекомбинантного IL-21 в присутствии фидерных клеток, несущих поверхностный CD40L. При IL-21/CD40L стимуляции изменялась морфология В-лимфоцитов и их функциональная активность. В-клетки, которые исходно имели сферический вид, в процессе стимуляции принимали нерегулярную форму с образованием псевдоподий, группировались вокруг фидерных клеток. Между В-лимфоцитами наблюдалась гомотипическая адгезия, одиночные клетки начали активно двигаться, клетки пролиферировали и их количество возрастало.

При стимуляции наблюдались также изменения фенотипа клеток. На 4-й день стимуляции около 20% клеток начинали коэкспрессировать антигены CD27 и CD38, к 10-му дню доля двойных позитивных CD27⁺CD38⁺ клеток увеличивалась до 40%. Одновременно с этим снижалась поверхностная экспрессия CD20 антигена. Наблюдалось также снижение доли клеток, несущих поверхностный IgG или IgM, при этом увеличивался процент лимфоцитов с внутриклеточным окрашиванием IgG. Уровень секреции IgG в культуральный супернатант возрастал более чем в 5 раз. В покоящихся В-лимфоцитах детектировался невысокий уровень Bcl-6, который при IL-21/CD40L стимуляции снижался ниже порога детекции. К 10-му дню экспансия В-клеток останавливалась, и они вступали в апоптоз.

Суммируя все наблюдаемые изменения, можно утверждать, что IL-21/CD40L стимулированные В-клетки по своим свойствам приближались к плазмабластам и плазматическим клеткам. Это согласуется с тем, что IL-21 инициирует STAT3 путь активации, который приводит к положительной регуляции транскрипционного фактора Blimp-1. Воздействие CD40L запускает альтернативный NF-κB сигнальный путь, который через ряд медиаторов, включая транскрипционный репрессор Bcl-6, снимает блокаду с Blimp-1. Таким образом, IL-21 и CD40L, действуя синергически, обеспечивают повышение активности Blimp-1, который в свою очередь определяет переход В-клеток в терминальную стадию дифференцировки, на которой происходит остановка клеточного деления и В-лимфоцит окончательно превращается в плазматическую клетку [3].

Для моделирования В-клеточной дифференцировки более привлекательным является удержание В-лимфоцита в состоянии пролиферирующих преплазмабластов, в котором выбор дальнейшей дифференцировки в пользу В-клеток памяти или плазматических клеток еще не сделан. Стабильно пролиферирующие В-клетки можно получить трансдукцией генов BCL6 и BCL2L1, которые кодируют транскрипционный фактор Bcl- 6 и анти-апоптотический белок Bcl-XL соответственно [8]. В экспериментах по трансдукции мы использовали более многочисленную популяцию IgM⁺ клеток, которые предварительно выделяли с помощью проточного сортировщика.

На разные сроки после начала IL-21/CD40L стимуляции к В-клеткам мы добавляли лентивирусные частицы, несущие гены BCL6 и BCL2L1, а также репортерный ген GFP. В зависимости от дозы и времени добавления лентивирусов было получено 9 различных вариантов трансдуцированных В-лимфоцитов. Каждые три дня с помощью проточной цитометрии мы подсчитывали количество лимфоцитов, после чего клетки пересаживали в новые лунки со свежими фидерными клетками и с добавлением IL-21.

После трансдукции некоторая доля В-лимфоцитов сохраняла свою жизнеспособность вплоть до 20-го дня культивирования, после чего наблюдалось устойчивое увеличение количества лимфоцитов (рис. 1). Лимфоциты трансдуцированные на 4-й день стимуляции демонстрировали более высокий уровень пролиферации, чем лимфоциты, трансдуцированные на 7-й день стимуляции. Оптимальная доза лентивируса обеспечивала пролиферацию в течении двух месяцев с начала стимуляции. Через 42 дня после начала стимуляции более 72% клеток сохраняли GFP-флуоресценцию (рис. 2А), коэкспрессировали антигены CD27 и CD38 (рис. 2Б), несли поверхностный CD20 и IgM, но оставались негативными по поверхностному IgG (рис. 2Д, Г). Трансдуцированные В-клетки сохраняли секрецию IgM, экспрессировали внутриклеточный Bcl-6 и Bcl-XL (рис. 3А), а также внутриклеточный IgM, но не IgG (рис. 3Б). Таким образом, культивирование В-клеток в течение 42 дней не приводило к переключение класса синтезируемого Ig.

 

Рисунок 1. Динамика роста В-клеток трансдуцированных генами BCL6 и BCL2L1

Примечание. Тонкой линий показан отрицательный контроль с В-клетками без трансдукции.

Figure 1. Dynamics of B cell growth after transduction with the BCL6 and BCL2L1 genes

Note. The thin line shows the negative control with B cells without transduction.

 

Рисунок 2. Фенотипирование трансдуцированных В-клеток на 42-й день после начала стимуляции по поверхностным маркерам

Примечание. А – распределение по флуоресценции GFP⁺ клеток. Линией показан отрицательный контроль. Б – коэкспрессия антигенов CD27 и CD38. В – экспрессия антигенов CD20 (слева), IgM (в центре), IgG (справа). Цифрами указаны % позитивных клеток.

Figure 2. Phenotyping of transduced B cells on day 42 after the start of stimulation using surface markers

Note. A,distribution of GFP⁺ cell fluorescence. The line shows the negative control. B, coexpression of CD27 and CD38 antigens. C, expression of antigens CD20 (left), IgM (center), and IgG (right). The numbers indicate the % of positive cells.

 

Рисунок 3. Фенотипирование трансдуцированных В-клеток на 42-й день после начала стимуляции по внутриклеточным маркерам

Примечание. А – пермеабилизованные клетки окрашивали антителами против Bcl-6 (слева) или Bcl-XL (справа) и вторичными антителами против IgG мыши, мечеными фикоэритрином. Для отрицательного контроля приведены гистограммы флуоресценции клеток, окрашенных только вторичными антителами. Б – экспрессия внутриклеточного IgM (слева) и IgG (справа) на GFP⁺ клетках. Цифрами указаны % позитивных клеток.

Figure 3. Phenotyping of transduced B cells on day 42 after the start of stimulation using intracellular markers

Note. A, Permeabilized cells were stained with antibodies against Bcl-6 (left) or Bcl-XL (right) and secondary antibodies against mouse IgG labeled with phycoerythrin. For the negative control, fluorescence histograms of cells stained with secondary antibodies only are shown. B, expression of intracellular IgM (left) and IgG (right) on GFP⁺ cells. The numbers indicate the % of positive cells.

 

Заключение

Таким образом, в настоящей работе показано, что первичные В-клетки крови, стимулированные в системе IL-21/CD40L и трансдуцированные генами BCL6 и BCL2L1, дифференцируются в плазмабласты, которые могут пролиферировать в течении нескольких недель. Такие клетки имитируют ключевые аспекты развития В-клеток в зародышевых центрах.

Разработанная система стимуляции может служить удобным инструментом для последующих исследований по дифференцировке наивных B-клеток в предшественники В-клеток памяти и плазматические клетки.

About the authors

M. G. Byazrova

Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency; P. Lumumba Peoples’ Friendship University of Russia

Email: avfilat@yandex.ru

Research Associate, Laboratory of Immunochemistry; Assistant, Department of Immunology, Medical Institute

Russian Federation, Moscow; Moscow

M. M. Sukhova

Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency; Lomonosov Moscow State University

Email: avfilat@yandex.ru

Junior Research Associate, Laboratory of Immunochemistry; Graduate Student, Department of Immunology, Faculty of Biology

Russian Federation, Moscow; Moscow

A. A. Mikhailov

Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency; Lomonosov Moscow State University

Email: avfilat@yandex.ru

Laboratory Assistant, Laboratory of Immunochemistry; Student, Department of Immunology, Faculty of Biology

Russian Federation, Moscow; Moscow

A. G. Prilipov

Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency

Email: avfilat@yandex.ru

PhD, MD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Immunochemistry

Russian Federation, Moscow

A. V. Filatov

Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency; Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: avfilat@yandex.ru

PhD, MD (Biology), Professor, Head of Laboratory of Immunochemistry; Professor, Department of Immunology, Faculty of Biology

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files