Tissue pool of hypersegmented neutrophils in patients with precancerous and tumor diseases of the larynx and laryngopharynx

Full Text

Введение

Развитие и течение опухолевых процессов обычно сопровождается привлечением иммунных клеток. При различных типах раков многие авторы отмечают увеличение численности циркулирующих в крови нейтрофилов [9]. Нейтрофильные гранулоциты (НГ) в большом количестве присутствуют и в очаге развития злокачественных новообразований. Показано, что миграция нейтрофилов в опухоль не всегда связана с воспалительной реакцией. В настоящее время считают, что в ткани опухоли нейтрофилы могут выполнять разные функции, осуществляя при этом про- либо противоопухолевое действие [4, 15]. В настоящее время получены многочисленные свидетельства, подтверждающие участие НГ на всех стадиях развития злокачественных новообразований, от инициации опухолевой трансформации до их инвазивного роста и метастазирования.

Известно, что присутствие нейтрофилов в опухоли часто коррелирует с неблагоприятным прогнозом, однако до сих пор нет однозначного ответа о роли опухоль-ассоциированных нейтрофилов (TAN – tumor-associated neutrophils) и о связи их морфофункциональных особенностей с прогнозом течения заболевания. ТАN представлены гетерогенной популяцией, в которой в настоящее время выделяют две разных по функциональным свойствам субпопуляции: N1 и N2 с противоопухолевыми и проопухолевыми свойствами соответственно [3]. Результаты клинических и экспериментальных исследований демонстрируют возможность нейтрофилов к функциональной и морфологической трансформации под влиянием факторов опухолевого микроокружения [6].

Хотя пластичность нейтрофилов изначально рассматривалась применительно к опухолевым процессам, в настоящее время ее значимость распространяется на различные клинические ситуации, включая хроническое воспаление и инфекционные заболевания.

Цель исследования – оценить структурные особенности ядер тканевых нейтрофилов в зоне патологического процесса у больных с предопухолевыми изменениями и злокачественными новообразованиями в области гортани и гортаноглотки.

Материалы и методы

Обследованы 8 человек с предопухолевыми изменениями в области гортани и гортаноглотки (5 – с хроническим гиперпластическим ларингитом, 3 – с дисплазией эпителия гортани), а также 32 пациента с впервые выявленным раком гортани и гортаноглотки, медианные значения возраста которых составили 57,6 (39-69) лет. Взятие материала у пациентов осуществлялось в эндоскопическом отделении НИИ онкологии ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», г. Томск (заведующий отделением – д.м.н. Черемисина О.В.). Группа условно здоровых доноров (21 человек сопоставимого возраста) сформирована во время профилактического осмотра. Все лица, биологический материал которых был использован в данной работе, проходили процедуру подписи информированного согласия на участие в научно-практическом исследовании.

В соответствии с классификацией TNM все пациенты с раком гортани и гортаноглотки были разделены на 2 группы: первую группу составили 18 пациентов с II и III стадиями опухолевого процесса и отсутствием метастазов (T_2-3N₀M₀), вторая группа состояла из 12 пациентов с III стадией опухолевых заболеваний, у которых были выявлены регионарные метастазы (T₃N_1-2M₀).

Материалом исследования стали мазки из гепаринизированной венозной крови и мазки-отпечатки, приготовленные из тканевых биоптатов пациентов НИИ онкологии, полученных из трех локализаций: 1 – зоны патологического очага; 2 – границы между патологическим очагом и неизмененной (условно здоровой) тканью; 3 – условно здоровой ткани. Мазки фиксировались в этиловом спирте в течение 10 мин и окрашивались в течение 30 мин по методу Романовского–Гимзы.

Основное внимание при анализе морфологических особенностей нейтрофилов уделяли структурным особенностям их ядер. Подсчет степени сегментированности ядер нейтрофилов в мазках крови и биоптатах был проведен с помощью микроскопа Zeiss Primo Star (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия) в стандартном режиме. Оценка степени сегментированности была проведена в 100 нейтрофильных гранулоцитах. В каждой клетке оценивалось количество сегментов в ядре с последующим выделением трех групп:

1. нейтрофилы, ядра которых содержат 2-3 сегмента;
2. нейтрофилы, ядра которых содержат 4 сегмента;
3. нейтрофилы, ядра которых содержат 5 и более сегментов.

Для анализа структурных особенностей был введен средний коэффициент сегментированности (СКС), который отражает распределение нейтрофильных гранулоцитов с ядрами различной степени сегментированности [2].

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения STATISTICA 10.0 (StatSoft, США). Для оценки характера распределения данных использовали критерий Шапиро–Уилка. Результаты представляли в виде медианы и межквартильного интервала – Me (Q_0,25-Q_0,75). Для исследования значимости различий применяли U-критерий Манна–Уитни

Результаты и обсуждение

Оценка степени сегментированности ядер нейтрофилов показала, что в крови условно здоровых добровольцев преобладали клетки с умеренно сегментированными ядрами (2-3 сегмента), и их количество было значимо выше (75 (69- 80)) %, чем в крови больных с предопухолевыми изменениями гортани (39 (35-48) %, р < 0,001) и больных раком гортани соответственно (51 (41-61) %, р < 0,001). В крови больных с предопухолевыми изменениями гортани и онкобольных основная часть нейтрофилов была представлена клетками с 4-сегментным ядром, а число гиперсегментированных форм (5 и более сегментов) было выше (9,5 (6-13) %; 10 (7-16) % соответственно ), чем в крови условно здоровых добровольцев2 (1-2) %; р < 0,002. В сравнении с пациентами, у которых диагностировали предопухолевые заболевания, у онкобольных отмечалось более высокое содержание умеренно сегментированных форм нейтрофилов (51 (41-61) %; 39 (35-48) %; р = 0,05) и меньшее число 4-сегментных нейтрофилов (38 (31-75) %; 50 (47-50) %; р = 0,07).

Изучение характера сегментированности тканевых нейтрофилов в разных локализациях патологического процесса показало, что у больных с предопухолевыми изменениями гортани и онкобольных выявляются во многом схожие характеристики популяционного состава (табл. 1).

 

ТАБЛИЦА 1. СЕГМЕНТИРОВАННОСТЬ ЯДЕР НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ В МАЗКАХ БИОПТАТОВ У БОЛЬНЫХ С ПРЕДОПУХОЛЕВЫМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ ГОРТАНИ, % (Mе (Q_0,25-Q_0,75))

TABLE 1. SEGMENTATION OF NEUTROPHIL GRANULOCYTE NUCLEI IN BIOPSY SMEARS IN PATIENTS WITH PRECANCEROUS LARYNGEAL CHANGES, % (Mе (Q_0.25-Q_0.75))

Число сегментов в ядрах Number of segments	Исследуемые зоны Study areas			р
	Здоровая ткань Healthy tissue	Граница патологического очага и здоровой ткани Border of the pathological focus and healthy tissue	Патологический очаг Pathological focus
2-3 сегмента 2-3 segments	64 (62-66)	41 (24-57)	20 (16-25)	р1-2 = 0,04 р1-3 < 0,001 р2-3 = 0,05
4 сегмента 4 segments	30 (27-33)	41 (38-45)	47 (43-53)	р1-2 = 0,05 р1-3 = 0,03 р2-3 = 0,33
5 и более сегментов 5 or more segments	6 (1-8)	11 (6-24)	27 (21-34)	р1-2 = 0,04 р1-3 < 0,001 р2-3 = 0,06
СКС ASC	1,43 (1,35-1,46)	1,50 (1,46-1,92)	2,00 (1,85-2,11)	р1-2 = 0,35 р1-3 < 0,001 р2-3 = 0,003

Примечание. СКС – средний коэффициент сегментированности; р – уровень значимости различий.

Note. ASC, аverage segmentation coefficient; p, the level of significance of differences.

 

Было выявлено, что при предопухолевых заболеваниях тканевые нейтрофилы с умеренной сегментированностью ядер (2-3 сегмента) преимущественно локализуются в здоровой ткани, а на границе со здоровой тканью и в зоне патологического очага их количество прогрессивно снижается. В то же время число 4-сегментных и гиперсегментированных форм нейтрофильных гранулоцитов возрастало по мере приближения к зоне патологического очага (табл. 1).

Важно, что при анализе степени сегментированности нейтрофилов в мазках биоптатов из разных зон патологического очага у больных раком гортани и гортаноглотки мы выявили аналогичные изменения: по мере приближения к опухоли наблюдалось увеличение содержания клеток, ядра которых имеют 4 сегмента, 5 и более сегментов, а содержание менее сегментированных форм было максимальным в здоровой ткани (табл. 2). Это отразилось на значениях показателя СКС (введенного нами интегрального показателя, отражающего степень сегментированности ядер нейтрофилов в общем пуле клеток), максимальные значения которого отмечались в опухолевой ткани.

 

ТАБЛИЦА 2. СЕГМЕНТИРОВАННОСТЬ ЯДЕР НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ В МАЗКАХ БИОПТАТОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ГОРТАНИ И ГОРТАНОГЛОТКИ, % (Mе (Q_0,25-Q_0,75))

TABLE 2. SEGMENTATION OF NEUTROPHIL GRANULOCYTE NUCLEI IN BIOPSY SMEARS IN PATIENTS WITH LARYNGEAL AND LARYNGOPHARYNGEAL CANCER, % (Mе (Q_0.25-Q_0.75))

Число сегментов в ядрах Number of segments	Исследуемые зоны Study areas			р
	Здоровая ткань Healthy tissue	Ближайшее окружение опухоли Immediate environment of the tumor	Опухоль Tumor
2-3 сегмента 2-3 segments	62 (47-76)	50 (40-54)	23 (15-32)	р1-2 = 0,007 р1-3 < 0,001 р2-3 < 0,001
4 сегмента 4 segments	27 (22-38)	42 (38-50)	50 (44-54)	р1-2 = 0,006 р1-3 < 0,001 р2-3 = 0,048
5 и более сегментов 5 or more segments	6 (2-9)	9 (4-15)	24,5 (14-32)	р1-2 = 0,2 р1-3 < 0,001 р2-3 < 0,001
СКС ASC	1,42 (1,26-1,63)	1,6 (1,5-1,73)	2,07 (1,82-2,19)	р1-2 = 0,2 р1-3 < 0,001 р2-3 < 0,001

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

Примечательно, что числовые значения СКС у пациентов с опухолями и предопухолевыми процессами статистически значимо не различались. Чтобы оценить связь распространенности опухолевого процесса с особенностями структурной организации тканевых нейтрофилов, был проведен сравнительный анализ сегментированности НГ в разных зонах патологического процесса у пациентов двух подгрупп: «локализованный рак» – больные без регионарных и отдаленных метастазов со II-ой и III-ей стадией опухолевого процесса (T_2-3N₀M₀); «распространкнный рак» – с III-ей стадией опухолевого процесса и регионарными метастазами (T₃N_1-2M₀).

В ходе проведения анализа внутри каждой подгруппы были выявлены однотипные статистически значимые различия, аналогичные изменениям в общей группе онкобольных: увеличение числа 4-сегментных и гиперсегментированных нейтрофилов по мере приближения к зоне роста опухоли и снижение численности менее сегментированных (2-3 сегмента) форм (табл. 3). Средний коэффициент сегментированности имел максимальные значения в зоне роста опухоли, а наименьшие – в биоптатах здоровой ткани.

 

ТАБЛИЦА 3. СЕГМЕНТИРОВАННОСТЬ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ В МАЗКАХ БИОПАТОВ ИЗ РАЗНЫХ ЗОН ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ОЧАГА У БОЛЬНЫХ ЛОКАЛИЗОВАННЫМ (T_2-3N₀M₀) И РАСПРОСТРАНЕННЫМ (T₃N_1-2M₀) РАКОМ ГОРТАНИ И ГОРТАНОГЛОТКИ , % (Mе (Q_0,25-Q_0,75))

TABLE 3. SEGMENTATION OF NEUTROPHIL GRANULOCYTES IN BIOPSY SMEARS FROM DIFFERENT AREAS OF THE PATHOLOGICAL FOCUS IN PATIENTS WITH LOCALIZED (T2-3N0M0) AND WIDESPREAD (T3N1-2M0) CANCER OF THE LARYNX AND LARYNX, % (Mе (Q_0.25-Q_0.75))

Число сегментов в ядрах Number of segments	Исследуемые зоны Study areas			р
	Здоровая ткань Healthy tissue	Ближайшее окружение опухоли Immediate environment of the tumor	Опухоль Tumor
Больные с локализованным раком (T2-3N0M0), n = 18 Patients with localized cancer (T2-3N0M0), n = 18
2-3 сегмента 2-3 segments	50 (33-57)	50 (46-54)	26 (22-31)	р1-2 = 1,00 р1-3 = 0,02 р2-3 = 0,01
4 сегмента 4 segments	38 (36-53)	40 (36-52)	51 (49-54)	р1-2 = 1,00 р1-3 = 0,10 р2-3 = 0,10
5 и более сегментов 5 or more segments	8 (6-13)	10 (3-14)	20 (15-27)	р1-2 = 1,00 р1-3 = 0,005 р2-3 = 0,04
СКС ASC	1,66 (1,50-1,80)	1,60 (1,55-1,62)	1,96 (1,84-2,10)	р1-2 = 0,84 р1-3 = 0,008 р2-3 = 0,01
Больные с распространенным раком (T3N1-2M0), n = 12 Patients with advanced cancer (T3N1-2M0), n = 12
2-3 сегмента 2-3 segments	64 (49-69)	38 (33-52)	24 (18-36)	р1-2 = 0,16 р1-3 = 0,01 р2-3 = 0,03
4 сегмента 4 segments	33 (26-37)	48 (40-55)	46 (43-59)	р1-2 = 0,05 р1-3 = 0,03 р2-3 = 0,6
5 и более сегментов 5 or more segments	6 (4-13)	9 (5-13)	22 (17-26)	р1-2 = 0,75 р1-3 = 0,03 р2-3 = 0,03
СКС ASC	1,39 (1,37-1,66)	1,73 (1,53-1,83)	1,93 (1,83-2,08)	р1-2 = 0,3 р1-3 = 0,01 р2-3 = 0,02

Примечание. СКС – средний коэффициент сегментированности; р – уровень значимости различий; n – число обследованных пациентов в каждой группе.

Note. ASC, аverage segmentation coefficient; p, the level of significance of differences; n is the number of examined patients in each group.

 

При межгрупповом сравнении показателей у больных с локализованным и распространенным раком мы не выявили каких-либо статистически значимых различий. Однако можно отметить, что только у пациентов с распространенным опухолевым процессом нейтрофилы с 4-сегментным ядром доминируют в ближайшем окружении опухоли (табл. 3). Обращает на себя внимание тенденция к изменению содержания слабо сегментированных нейтрофилов в здоровой ткани и окружении опухоли, проявившаяся при распространенном раке в большем их числе в неизмененной ткани и сниженном – в опухолевом окружении (табл. 3).

В настоящее время общепринятым является представление о существовании двух основных фенотипов НГ при развитии онкологических заболеваний: N1 – противоопухолевый и N2 – проопухолевый. НГ с гиперсегментированными ядрами многие авторы рассматривают, как N1-нейтрофилы, обладающие повышенным цитотоксическим потенциалом и способностью к продукции провоспалительных медиаторов [3, 10]. В то же время на модели острого воспаления и у пациентов с тяжелыми травмами другие авторы показали, что гиперсегментированные НГ клетки обладают иммуносупрессивным, т.е потенциально проопухолевым эффектом [13].

В проведенных нами ранее исследованиях было выявлено, что в системной циркуляции у здоровых добровольцев доминируют НГ с умеренной степенью сегментированности (2-3 сегмента) и практически не встречаются гиперсегментированные формы, тогда как в крови онкобольных их содержание существенно повышено и возрастает по мере распространения опухолевого процесса [2]. Настоящее исследование продемонстрировало, что повышенное содержание в крови гиперсегментированных НГ характерно и для пациентов с предопухолевыми процессами. Известно, что к предопухолевым процессам относят усиленную пролиферацию и гиперплазию, а также нарушения дифференцировки в виде метаплазии и дисплазии. Возникновение таких нарушений предполагает не только наличие клеток с измененным функциональным статусом, но и способность таких клеток трансформировать и подчинять себе окружающее пространство. Формирование «опухолевой ниши» является важнейшим условием малигнизации и дальнейшего развития опухоли. В состав клеточного пула «опухолевой ниши», несомненно, входят и нейтрофилы, гиперсегментация ядер которых является, по-видимому, адаптационной структурной трансформацией, необходимой для реализации функций в сформировавшемся патологическом очаге.

Хорошо известно, что НГ инфильтрируют многие органы и ткани даже в условиях здоровья, что свидетельствует об их гистофизиологическом потенциале [1]. Причем, гомеостатическая роль нейтрофилов может быть реализована как с помощью потенциально деструктивных факторов, так и посредством влияния на экспрессию генов, контролирующих пролиферативные процессы и ангиогенез в ходе репаративных процессов [1].

Предопухолевые процессы, как и злокачественные новообразования, характеризуются усиленной пролиферацией и гиперплазией. У обследованных нами пациентов с предопухолевыми изменениями гортани содержание 4-сегментных и гиперсегментированных нейтрофилов было достоверно повышено в «пограничной» зоне и непосредственно в очаге патологического процесса. Т.е. уже на стадии предопухолевых заболеваний, вероятно, в связи с длительным хроническим воспалением, в тканевом пуле клеток происходит накопление гиперсегментированных гранулоцитов. Подобная закономерность отмечена и при анализе мазков биоптатов, полученных от пациентов с раком гортани и гортаноглотки, причем, значения средних коэффициентов сегментации из разных зон патологического очага практически совпадали с аналогичными показателями пациентов с предраками. Известно, что микроокружение опухоли характеризуется стойким воспалением, при этом обсуждается как негативная, так и позитивная роль тканевых нейтрофилов [13]. В частности, способность нейтрофилов рекрутироваться и впоследствии контролировать воспаление может являться решающим звеном в формировании опухоли и дальнейшей её прогрессии.

Сравнительный анализ степени сегментированности ядер нейтрофилов на примере опухолевого процесса у больных c локализованным и распространенным раком гортани и гортаноглотки показал, что в обеих подгруппах наблюдалась тенденция к увеличению содержания 4-сегментных и гиперсегментированных нейтрофилов и снижению менее сегментированных форм по мере приближения к зоне опухолевого очага. Средний коэффициент сегментированности также увеличивался и в зоне роста опухоли достигал максимальных значений. При этом в группе онкобольных без регионарных метастазов (T_2-3N₀M₀) не наблюдалось достоверных различий по содержанию нейтрофилов разной степени сегментированности в здоровой ткани и ближайшем опухолевом окружении. В то же время у пациентов с распространенным раком (T₃N_1-2M₀) в ближайшем окружении опухоли было существенно снижено число слабосегментированных гранулоцитов и повышено содержание нейтрофилов с 4-мя сегментами. Вероятно, увеличение сегментированности ядер опухоль-инфильтрирующих нейтрофилов может свидетельствовать об увеличении риска метастазирования опухоли. Подтверждением этому могут служить результаты экспериментальных исследований о способности нейтрофилов влиять на миграцию опухолевых клеток, а значит, и стимулировать метастазирование [8].

До настоящего времени остаются неразрешенными многие важные вопросы, касающиеся клеточного происхождения и разнообразия ассоциированных с опухолью нейтрофилов, в частности, закономерности их инфильтрации в опухолевую ткань, а также фенотипические изменения, которым они подвергаются в «опухолевой нише», включая происхождение N2-нейтрофилов [5]. Предположительно, нейтрофилы с проканцерогенным фенотипом (N2) могут образовываться в костном мозге под влиянием стимулов, исходящих от опухолевых клеток. Второй механизм образования нейтрофилов популяции N₂ может быть связан с трансформацией нейтрофилов N1 непосредственно в опухоли под влиянием продуцируемых ею факторов [12]. В недавно проведенном экспериментальном исследовании убедительно показано, что опухолевую ткань инфильтрируют как зрелые, так и незрелые нейтрофилы костномозгового происхождения [11]. При попадании в опухоль эти субпопуляции реализуют различные эпигенетические и транскрипционные программы, обозначенные авторами как T1 и T2 (аналогичные N1 и N2). Более того, было отмечено дальнейшее перепрограммирование НГ внутри опухоли, приводящее к конвергенции T1 и T2 в новую, окончательно дифференцированную популяцию TAN, обозначенную как T3, при этом устранение факторов, способствующих дифференцировке T1/T2 в T3, не изменяло фенотип клеток на противоположный. По мнению Fridlender Z.G. и соавт., детально проанализировавших это исследование, процессы перепрограммирования НГ под влиянием локальных стимулов могут происходить и при многих хронических воспалительных заболеваниях [5].

Состав и плотность клеточного инфильтрата опухолевого микроокружения определяется как локальными хемокиновыми сигналами, так и миграционной способностью клеток. Высокая мобильность зрелых нейтрофилов связана, в том числе, с наличием уникальной многолопастной формы ядра, обеспечивающей быстрое проникновение в ткани через тесные межклеточные контакты [7, 14]. В таком случае гиперсегментация ядер может максимально ускорять миграционные процессы, опосредованно способствуя приобретению проопухолевого фенотипа.

Заключение

Таким образом, на этапе предопухолевых изменений и на ранних стадиях развития опухоли (T_2-3N₀M₀) состав тканевых пулов нейтрофилов на границе патологического очага и в неизмененной ткани совпадает по своим морфологическим характеристикам, но по мере распространения опухолевого процесса (T₃N_1-2M₀) в популяции тканевых гранулоцитов, так же, как и в системном кровотоке [2], увеличивается доля гиперсегментированных клеток. Весьма вероятно, что отмеченные нами морфологические особенности тканевых НГ в разных зонах патологического очага отражают их функциональную гетерогенность, поэтому могут рассматриваться в качестве потенциальных предикторов развития и прогрессирования онкологических заболеваний. Совершенствование наших знаний о молекулярных механизмах, лежащих в основе гиперсегментации ядер НГ, может способствовать выбору новых терапевтических мишеней для лечения острых и хронических воспалительных процессов, а также для контроля функционального статуса нейтрофилов в очаге опухолевого роста.

About the authors

E. N. Kologrivova

Siberian State Medical University

Author for correspondence.
Email: enkologrivova@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Immunology and Allergology

Russian Federation, 2 Moskovsky Trakt, Тomsk, 643050

R. I. Pleshko

Siberian State Medical University

Email: enkologrivova@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Morphology and General Pathology

Russian Federation, 2 Moskovsky Trakt, Тomsk, 643050

O. V. Cheremisina

Тomsk National Research Medical Center, Russian Academy of Sciences

Email: enkologrivova@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Head, Endoscopy Department, Cancer Research Institute

Russian Federation, Тomsk

M. A. Boldyshevskaya

Тomsk National Research Medical Center, Russian Academy of Sciences

Email: enkologrivova@mail.ru

Doctor of Clinical Laboratory Diagnostics, Pathological and Anatomical Department, Cancer Research Institute

Russian Federation, Тomsk

E. A. Gereng

Siberian State Medical University

Email: enkologrivova@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Morphology and General Pathology

Russian Federation, 2 Moskovsky Trakt, Тomsk, 643050

T. F. Nasibov

Siberian State Medical University

Email: enkologrivova@mail.ru

5^th year Sudent

Russian Federation, 2 Moskovsky Trakt, Тomsk, 643050

References

Supplementary files