Response of lymphoid organs to immunization with Fc fragments of IgG carrying epitopes specific to regulatory rheumatoid factor

L. V. Beduleva; Бедулева Л. В.; A. Yu. Sidorov; Сидоров А. Ю.; A. S. Terentiev; Терентьев А. С.; K. V. Fomina; Фомина К. В.; I. V. Menshikov; Меньшиков И. В.

doi:10.46235/1028-7221-16653-ROL

Response of lymphoid organs to immunization with Fc fragments of IgG carrying epitopes specific to regulatory rheumatoid factor

Authors: Beduleva L.V.¹^,2, Sidorov A.Y.¹^,2, Terentiev A.S.¹^,2, Fomina K.V.¹^,2, Menshikov I.V.¹^,2
Affiliations:
1. Udmurt State University
2. Udmurt Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences
Issue: Vol 27, No 4 (2024)
Pages: 763-768
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 27.03.2024
Accepted: 30.03.2024
Published: 25.10.2024
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/16653
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-16653-ROL
ID: 16653

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Previously, we identified a new factor of autoimmunity downregulation, called regulatory rheumatoid factor (regRF). The production of regRF was associated with the resistance of animals to the experimental autoimmune diseases or with the remission in animals that are sensitive to the autoimmune diseases. The action of regulatory rheumatoid factor is based on the killing of activated CD4 T lymphocytes expressing PD-1, which makes it possible to restrain the expansion of lymphocytes, including autoreactive ones. RegRF-specific epitopes (regRF epitopes) can be induced on IgG Fc fragments. Immunization of rats with homologous IgG Fc fragments bearing regRF epitopes suppresses symptoms, lymphocytic infiltration and target tissue damage in several experimental models of autoimmune diseases. An in vitro study of the mechanisms of regRF-producing lymphocytes activation by IgG Fc fragments carrying regRF epitopes showed that IgG Fc fragments carrying regRF epitopes are T cell-independent antigens type 2. The reactions of the immune system, in particular in lymphoid organs, to T cell-independent antigens type 2, especially having a protein nature, are poorly studied. The purpose of this work is to study the reactions of the spleen and lymph nodes of rats to immunization with IgG Fc fragments carrying regRF epitopes. Wistar rats were immunized subcutaneously with 500 μg of homologous IgG Fc fragments carrying regRF epitopes. Control animals received an injection of phosphate-buffered saline. Immunization with IgG Fc fragments carrying regRF epitopes caused a transient increase of regulatory rheumatoid factor blood level with a maximum on day 7 after immunization. It was found that immunization with IgG Fc fragments carrying regRF epitopes does not cause a reaction in the regional and distal lymph nodes of rats, but induces the development of secondary follicles in spleen that exist for at least 28 days. On day 49, the number of follicles with germinal centers in the spleen of rats immunized with IgG Fc fragments carrying regRF epitopes was lower than in control rats. Consequently, the reaction of splenic follicles in rats immunized with IgG Fc fragments carrying regRF epitopes is transient. No changes were detected in the periarteriolar lymphoid sheaths (splenic T cell zone) in rats immunized with IgG Fc fragments carrying regRF epitopes. Thus, IgG Fc fragments carrying regRF epitopes, being a T cell-independent antigens type 2, do not cause a reaction in the lymph nodes, but induce the development of germinal centers in the spleen that exist for several weeks.

Keywords

IgG Fc fragments, regulatory rheumatoid factor, germinal centers, spleen, epitope, T cell-independent antigens type 2

Full Text

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (FEWS-2024-0002).

Введение

Ранее нами был выявлен новый фактор иммунорегуляции, получивший название регуляторный ревматоидный фактор (регРФ) [2, 11]. В экспериментальных моделях аутоиммунных заболеваний продукция регРФ ассоциирована с устойчивостью животных к развитию аутоиммунного заболевания, а у животных, оказавшихся чувствительными к болезни, с ремиссией [2]. Действие регуляторного ревматоидного фактора основано на киллинге активированных CD4 Т-лимфоцитов, экспрессирующих PD-1, что позволяет сдерживать экспансию лимфоцитов, в том числе аутореактивных [7]. Эпитопы специфичные к регРФ (регРФ эпитопы) могут быть индуцированы на Fc-фрагментах IgG. Иммунизация крыс гомологичными Fc-фрагментами IgG несущими регРФ эпитопы подавляет симптомы, лимфоцитарную инфильтрацию и ослабляет повреждение тканей-мишеней в нескольких экспериментальных моделях аутоиммунных заболеваний [1, 3, 4, 11]. Исследование механизмов активации регРФ-продуцирующих лимфоцитов Fc-фрагментами IgG, несущими регРФ эпитопы, выполненное in vitro, показало, что Fc-фрагменты IgG, несущие регРФ эпитопы, являются Т-независимыми антигенами 2-го типа [12]. Реакции иммунной системы, в частности лимфоидных органов, на T-независимые антигены 2-го типа, особенно белковой природы, плохо изучены. Целью настоящей работы было изучение реакций селезенки и лимфоузлов на подкожную иммунизацию Fc-фрагментами IgG, несущими регРФ эпитопы.

Материалы и методы

Крысы Wistar (n = 15) (питомник лабораторных животных «Рапполово», Россия) были иммунизированы Fc-фрагментами IgG, несущими регРФ эпитопы, в терапевтически эффективной дозе – 500 мкг однократно подкожно в заднюю часть спины. Контрольная группа крыс (n = 14) получила подкожную инъекцию ЗФР. У крыс еженедельно определяли уровень регРФ в крови. Через 28 и 49 дней после введения Fc-фрагментов IgG, несущих регРФ эпитопы, или инъекции ЗФР крыс подвергали эвтаназии, извлекали селезенку, проксимальные и дистальные дренирующие лимфоузлы (паховый и каудальный подмышечный). Готовили парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином-эозином. На поперечных срезах селезенки и лимфоузлов подсчитывали количество вторичных фолликулов (фолликулы с зародышевыми центрами). Срезы селезенки были окрашены также FITC меченными антителами к СD3 (Elabscience, Китай) и DAPI (Abcam, Великобритания) для изучения Т-клеточных зон селезенки. Микроскоп Olympus B×53 (Япония) был предоставлен ЦКПП УдмФИЦ УрО РАН. Статистический анализ проводили с помощью GraphPad Prism 8.4.3. Достоверность различий оценивали с помощью t-теста. Отличия считали значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Иммунизация Fc-фрагментами IgG вызвала транзиторное увеличение регРФ в крови крыс с максимумом на 7-й день после иммунизации. При исследовании регионарных (проксимальных) и дистальных лимфоузлов не было выявлено различий в количестве фолликулов с зародышевыми центрами (вторичных фолликулов) между крысами, иммунизированными Fc-фрагментами IgG, несущими регРФ-эпитопы, и контрольными крысами как на 28-й, так и на 49-й день после иммунизации (табл. 1).

ТАБЛИЦА 1. КОЛИЧЕСТВО ФОЛЛИКУЛОВ С ЗАРОДЫШЕВЫМИ ЦЕНТРАМИ В ЛИМФОУЗЛАХ И СЕЛЕЗЕНКЕ КРЫС, ИММУНИЗИРОВАННЫХ Fc-ФРАГМЕНТАМИ IgG, НЕСУЩИХ регРФ-ЭПИТОПЫ, И КОНТРОЛЬНЫХ КРЫС, СРЕДНЕЕ±SD

TABLE 1. NUMBER OF FOLLICLES WITH GERMINAL CENTERS IN THE LYMPH NODES AND SPLEEN OF RATS IMMUNIZED WITH IgG Fc FRAGMENTS BEARING regRF EPITOPES AND CONTROL RATS, MEAN±SD

	Лимфоузлы Lymph nodes				Селезенка Spleen
	28-й день day 28		49-й день day 49		28-й день day 28	49-й день day 49
	(n = 9)		(n = 5)		(n = 9)	(n = 5)
	паховый inguinal	подмышечный axillary	паховый inguinal	подмышечный axillary
Крысы, иммунизированные Fc-фрагментами IgG несущими регРФ эпитопы Rats immunized with IgG Fc fragments bearing regRF epitopes	1,76±0,92	0,73±0,50	1,32±0,54	1,16±0,68	¹⁾7,33±3,17*	²⁾ 2,18±0,40*
	(n = 10)		(n = 5)		(n = 10)	(n = 5)
Контрольная группа (инъекция ЗФР) Control group (PBS injection)	2,74±1,32	1,34±1,05	1,08±0,48	0,60±0,55	4,63±2,03	4,27±1,71

Примечание: ¹⁾ * t test, p = 0,039 (относительно контроля); ²⁾ * t test, p = 0,029 (относительно контроля). ЗФР – забуференный физиологический раствор.

Note. ¹⁾ * t test, p = 0.039 (relative to the control group); ²⁾ * t test, p = 0.029 (relative to the control group). PBS – phosphate buffered saline.

Анализ количества вторичных фолликулов в селезенке выявил, что на 28-й день у крыс, иммунизированных Fc-фрагментами IgG, несущими регРФ эпитопы, количество вторичных фолликулов значимо больше количества вторичных фолликулов у крыс, получивших инъекцию ЗФР (табл. 1). Как известно, вторичные фолликулы (фолликулы с зародышевыми центрами) представляют собой антигензависимые структуры – скопления пролиферирующих в ответ на антиген В-лимфоцитов. Следовательно, иммунизация Fc-фрагментами IgG, несущими регРФ эпитопы, вызывает пролиферацию фолликулярных В-лимфоцитов селезенки. Goud и соавт., изучая ответ селезенки и регионарных лимфоузлов на T -независимые антигены, показали, что подкожная иммунизация T-независимым антигеном 2-го типа TNP-Ficoll, как в растворе, так и эмульсии с адъювантом Фрейнда, не вызывала ответа В-лимфоцитов регионарных лимфатических узлов, в то время как в селезенке найден хороший ответ бляшкообразующих клеток [6]. Следовательно, обнаруженное нами увеличение количества вторичных фолликулов селезенки крыс в отсутствии реакции лимфоцитов лимфоузлов в ответ на подкожную иммунизацию Fc-фрагментами IgG, несущими регРФ-эпитопы, согласуется с данными других исследователей о реакции лимфоидных органов на T-независимые антигены 2-го типа.

Данные литературы о локализации в селезенке В-лимфоцитов, отвечающих на Т-независимые антигены 2-го типа, противоречивы. Nutt и соавт. показали, что Т-независимые антигены 2-го типа в селезенке вызывают внефолликулярную пролиферацию B-лимфоцитов, стихающую в течение нескольких дней [10]. Другие исследователи обнаружили, что некоторые полисахаридные антигены, являющиеся Т-независимыми антигенами, могут стимулировать образование зародышевых центров, но также существуют всего несколько дней [5, 8]. Xin Liu и соавт. показали, что Т-независимые антигены 2-го типа NP30-Ficoll и декстран могут индуцировать временное образование зародышевых центров в селезенке мышей с формированием плазматических клеток и долгоживущих В-клеток памяти [9]. Fc-фрагменты IgG, несущие регРФ эпитопы, являясь T-независимым антигеном 2-го типа, вызывают образование зародышевых центров, что предполагает возможность формирования клеток памяти. Кроме того, вторичные фолликулы, индуцированные Fc-фрагментами IgG, несущими регРФ эпитопы, обнаруживаются спустя 28 дней после иммунизации, то есть сохраняются относительно долго.

Мы так же исследовали срезы селезенки спустя 49 дней после иммунизации Fc-фрагментами IgG, несущими регРФ-эпитопы. На 49-й день количество фолликулов с зародышевыми центрами у крыс, иммунизированных Fc-фрагментами IgG, несущими регРФ-эпитопы, ниже, чем у контрольных крыс, получивших инъекцию ЗФР (табл. 1). Следовательно, реакция селезенки на Fc-фрагменты IgG, несущие регРФ-эпитопы, является транзиторной.

Чтобы выяснить, вызывает ли иммунизация Fc-фрагментами IgG, несущими регРФ-эпитопы, изменения в Т-клеточной зоне селезенки – периартериальных лимфоидных муфтах, был проведен иммуногистохимический анализ селезенки. Т-лимфоциты периартериальной лимфоидной муфты селезенки крыс характеризуются слабой экспрессией CD3. Особенностей периартериальной лимфоидной муфты крыс, иммунизированных Fc-фрагментами IgG, несущими регРФ эпитопы, отличающих ее от периартериальной лимфоидной муфты крыс, получивших инъекцию ЗФР, не найдено.

Заключение

Таким образом, Fc-фрагменты IgG, несущие регРФ-эпитопы, являясь Т-независимым антигеном 2-го типа, не вызывают реакцию лимфоузлов, но индуцируют образование зародышевых центров в селезенке, сохраняющихся несколько недель.